[發明專利]微量循環腫瘤細胞的分離方法

無效

• 申請號: 201310219229.X
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN103275934A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 許恒毅
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

1.微量循環腫瘤細胞的分離方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)氨基化樹狀分子與循環腫瘤細胞相應的特異性物質偶聯，摩爾投料比為1:1，形成樹狀分子-特異性物質復合物；

(2)將樹狀分子-特異性物質復合物與長鏈生物素偶聯，加入過量長鏈生物素以封閉樹狀分子上裸露的氨基位點，形成長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質復合物;

(3)將上述長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質復合物溶液加入到全血樣品溶液中，以捕獲全血樣品溶液中的CTCs，形成長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質-CTCs復合物；

(4)將修飾有鏈霉親和素的納米磁珠加入到上述混合溶液中通過鏈霉親和素與長鏈生物素的親和作用捕獲長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質-CTCs復合物，以形成終復合物納米磁珠-鏈霉親和素-長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質-CTCs；

(5)將終復合物溶液置于磁力架上進行分離，去離子水輕輕清洗后，用PBS緩沖液重懸即得富集有CTCs的的納米磁珠-鏈霉親和素-長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質-CTCs復合物。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述樹狀分子為氨基化的聚酰胺-胺型樹枝狀高分子PAMAM-G4，其分子量為14215?Da。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1）中樹狀分子通過氨基和特異性物質的羧基實現樹狀分子和特異性物質的共價偶聯。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2）中樹狀分子通過氨基和長鏈生物素分子的羧基，實現樹狀分子和長鏈生物素的共價偶聯；加入過量長鏈生物素以保證封閉樹狀分子上裸露的氨基位點。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述修飾了鏈霉親和素的納米磁珠粒徑為20-50?nm，優選為30?nm。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1）所述的制備摩爾投料比為1:1的樹狀分子-特異性物質復合物，按照如下步驟制備:

（1）每取10.5?mg氨基化的聚酰胺-胺型樹枝狀高分子?PAMAM?G4溶解于2?mL?0.02?M，pH?6.5磷酸緩沖液PBS，加入0.6?mg?N-羥基丁二酰亞胺NHSS，0.4?mg?乙基3-（3-二甲氨基）碳二亞胺鹽酸鹽EDC，室溫置于混勻儀上攪拌，活化15?min；

（2）取與上述加入的PAMAM?G4摩爾投料比為1:1的特異性物質，加入上述反應液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；

（3）將上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2）所述的長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質復合物按照如下步驟制備：

（1）每取22.5?mg?長鏈生物素，5.4?mg?NHSS，3.6?mg?EDC溶解于3?mL?0.02?M?pH?6.5?PBS緩沖液中；

（2）將8.0?mg樹狀分子-特異性物質復合物加入到上述溶液中，室溫置于混勻儀上攪拌30?min；

（3）將上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析1?d；透析結束將得到的溶液冷凍干燥。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3）、（4）具體包括如下步驟：

取1?mL人新鮮全血，加入0.2?mg特異性物質和長鏈生物素共修飾的樹狀分子，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速室溫孵育15?min；加入0.2?mg修飾有鏈霉親和素的納米磁珠加入到上述溶液中，置于混勻儀上，以30?rpm的轉速再室溫孵育15?min，常規磁力架分離3?min；磁力分離后，去離子水輕輕清洗，用PBS緩沖液重懸即得富集有CTCs的納米磁珠-鏈霉親和素-長鏈生物素-樹狀分子-特異性物質-CTCs復合物。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述循環腫瘤細胞相應的特異性物質包括：抗HER2抗體對應乳腺癌SK-BR-3細胞、抗上皮細胞粘附因子EpCAM抗體對應乳腺癌MCF-7細胞、葉酸對應子宮頸癌HeLa細胞、轉鐵蛋白Tf對應轉鐵蛋白受體陽性TfR⁺癌HCT116?細胞、表皮生長因子對應鱗狀細胞癌Tu212細胞。