[發(fā)明專利]一種基于雙向等溫延伸的核酸合成方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310219029.4
• 申請(qǐng)日: 2013-06-03
• 公開（公告）號(hào): CN104212791B
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林繼偉;戴俊彪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 無錫青蘭生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

本發(fā)明涉及一種雙向等溫延伸的核酸拼接方法。該方法是設(shè)立一個(gè)延伸體系,延伸體系由一個(gè)起始雙鏈,一組相互不同并能有序拼接的寡核苷酸,一個(gè)含有連接,聚合和限制性內(nèi)切酶活性的混合酶,以及與混合酶配套的反應(yīng)緩沖液組成；在多種酶的協(xié)作下,這些寡核苷酸以起始鏈為起始進(jìn)行等溫拼接,合成目標(biāo)DNA長(zhǎng)鏈。本發(fā)明具有成功率高、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單和操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化高等特點(diǎn),因而具有潛在的低成本優(yōu)勢(shì),對(duì)于基因合成的推廣,生物工程,生物醫(yī)學(xué)和生物信息學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展存在潛在的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種核酸合成領(lǐng)域的方法,特別是一種雙向等溫延伸的核酸拼接方法。

背景技術(shù)

隨著生物技術(shù)和生物醫(yī)藥的發(fā)展,對(duì)核酸特別是DNA序列的設(shè)計(jì)和修改正越來越獲得重視。傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增,克隆,重組和突變方法只能獲得自然界已有或接近自然界已有的DNA序列,而DNA的化學(xué)合成技術(shù)可以合成用戶指定的寡核苷酸序列,但由于化學(xué)反應(yīng)的效率和出錯(cuò)率問題,這些寡核苷酸序列通常長(zhǎng)度小于120-200個(gè)堿基.要獲得幾百個(gè)甚至幾百萬(wàn)個(gè)堿基長(zhǎng)度的DNA序列,就需要將這些寡核苷酸拼接起來。常見的拼接方法有:1)基于連接酶的方法(下面稱為連接酶法),2)基于聚合酶的方法(聚合酶法)以及基于DNA重組的方法(重組法)。

連接酶法是最早出現(xiàn)的DNA拼接技術(shù)(Khorana et al.(1979)Science.203:614-25;Smith et al.(1982) Nucleic Acids Res.10:4467-82;Edge et al.(1983)NucleicAcids Res.11:6419-35)。在這個(gè)方法中,目標(biāo)DNA 序列被分解成寡核苷酸片段,相鄰的片段之間存在重疊,這些片段被化學(xué)合成并磷酸化后,就可以自組裝成更長(zhǎng)的存在缺刻的序列,在連接酶(比如,T4DNA連接酶,Taq DNA連接酶,Pfu DNA連接酶等)的作用下,這些缺口被修復(fù),從而獲得目標(biāo)DNA序列。基于模板的連接酶法(U.S.Pat.No.6110668)和固相法(U.S. Pat.App.Pub.Nos.2005/0106606A1,2011/0124055A1)是連接酶法的衍生方法。

在上世紀(jì)90年代,出現(xiàn)了聚合酶法DNA拼接技術(shù)(Stemmer et al.(1995)Gene164:49-53;Hoover et al. (2002)Nucleic Acids Res.30:e43;Cherry et al.(2008)J.Biochem.Biophys.Methods.70:820-22)。由于這個(gè)方法的簡(jiǎn)單和快速,使之迅速在DNA合成領(lǐng)域占據(jù)了非常重要的位置。在這個(gè)方法中,寡核苷酸的設(shè)計(jì)與連接酶法非常相似,而拼接的過程則非常類似于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),在聚合酶(如Taq DNA聚合酶,Pfu DNA聚合酶等)的作用下,相互雜交的寡核苷酸被聚合延長(zhǎng),在每個(gè)溫度循環(huán)中,寡核苷酸或中間產(chǎn)物都會(huì)經(jīng)歷一次變性,退火和延伸的過程,而其長(zhǎng)度也會(huì)逐漸增加,直至獲得全長(zhǎng)的序列。這些全長(zhǎng)序列可以作為模板用于后續(xù)擴(kuò)增。

近幾年,基于重組和等溫的DNA拼接技術(shù)正越來越受到歡迎,因?yàn)樗鼈儾僮鞲雍?jiǎn)單。一種基于酵母體內(nèi)重組的技術(shù)(Gibson et al.(2009)Nucleic Acids Res.37(20):6984-90)利用酵母細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)大的重組系統(tǒng)來在一步之內(nèi)拼接寡核苷酸和載體,而另一種基于體外重組的技術(shù)被稱為吉布森拼接(Gibson assembly)(Gibson et al.(2010)NatureMethods.7:901-3),它利用3種酶(即T5外切酶,Phusion聚合酶和Taq 連接酶)的相互協(xié)作,在一步之內(nèi)將寡核苷酸和載體拼接起來,雖然這種方法嚴(yán)格來說并不是重組,但其能組裝DNA末端之間存在幾十個(gè)堿基重疊的序列,這一點(diǎn)與重組非常相似。上述兩種方法與連接酶法或聚合酶法比較起來,省略了溫度循環(huán),PCR擴(kuò)增,割膠純化,限制性內(nèi)切酶酶切和連接等操作,使得DNA合成變得更加容易自動(dòng)化。