[發明專利]一種基于雙向等溫延伸的核酸合成方法

有效

• 申請號: 201310219029.4
• 申請日: 2013-06-03
• 公開（公告）號: CN104212791B
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 林繼偉;戴俊彪
• 申請（專利權）人: 無錫青蘭生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種基于雙向等溫延伸的核酸合成方法,包括以下步驟：

設立一個延伸體系,延伸體系由一個起始雙鏈,一組相互不同并能有序拼接的寡核苷酸,一個含有連接,聚合和限制性內切酶活性的混合酶,以及與混合酶配套的反應緩沖液組成；在多種酶的協作下,這些寡核苷酸以起始鏈為起始進行等溫拼接,合成目標DNA長鏈；所述的寡核苷酸組中的每個寡核苷酸都是帶有2-10個堿基懸掛的發夾結構,發夾結構內部含有一個內切酶識別序列，寡核苷酸的5'端沒有磷酸化；

所述的拼接過程如下：

連接酶將起始雙鏈與體系中存在的某個發夾結構進行連接，聚合酶延伸使得發夾結構打開,限制性內切酶位點成為雙鏈；限制性內切酶對已經成為雙鏈的位點進行切割；然后延伸按下面3個步驟循環進行，直至合成目標DNA長鏈:

(1)連接酶將切割產生的末端與體系中存在的某個發夾結構進行連接；

(2)聚合酶延伸使得發夾結構打開,限制性內切酶位點成為雙鏈；

(3)限制性內切酶對已經成為雙鏈的位點進行切割；

其特征在于，所述起始雙鏈是一個線性載體，是從目標序列的5'端和3'端向內延伸,最后在序列的中間發生連接,從而得到一個環化的DNA分子。