[發(fā)明專利]條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310218003.8
• 申請日: 2013-06-04
• 公開（公告）號: CN103288954A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李強(qiáng);王友娟;李華;葉仕根;孫志鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 大連海洋大學(xué);李強(qiáng)
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體及其制備方法。

背景技術(shù)

條石鯛虹彩病毒（Red?bream?iridovirus，RBIV）是導(dǎo)致條石鯛養(yǎng)殖嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的主要病原體，其跨膜蛋白是細(xì)胞識別的重要抗原表位，因而也是藥物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵靶標(biāo)及制備疫苗的抗原。ORF049L是條石鯛虹彩病毒的一個(gè)非常重要的跨膜蛋白，Kim等（2007）研究發(fā)現(xiàn)利用條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白制備的多克隆抗體可阻斷RBIV對藍(lán)太陽魚鰓細(xì)胞（BF-2）的侵染，具有一定的中和作用，而且依賴該蛋白抗體可建立條石鯛虹彩病毒的特異性免疫學(xué)檢測技術(shù)。多克隆抗體雖然具有檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但其成本高，產(chǎn)量少，并易受到動(dòng)物組織及其它病原體干擾而出現(xiàn)假陽性，給實(shí)際應(yīng)用帶來不便。單克隆抗體可以特異性識別單一抗原決定簇，能夠在實(shí)驗(yàn)室通過細(xì)胞培養(yǎng)而得到批量生產(chǎn)，在診斷上具有專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，有較高的使用價(jià)值，而且還可以對強(qiáng)毒株和弱毒株進(jìn)行鑒別診斷，同時(shí)還能克服PCR檢測易出現(xiàn)假陽性和對相關(guān)操作人員技能要求的缺點(diǎn)。但是，迄今為止尚未有關(guān)于條石鯛虹彩病毒跨膜蛋白ORF049L單克隆抗體的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體及其制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體，其特征在于：所述的單克隆抗體是由保藏號為CGMCC?No.7304的抗條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株所分泌，結(jié)合的抗原是分子量為16.9kDa的條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白。

一種山述條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行：

a.??通過基因克隆、原核表達(dá)獲得分子量為16.9kDa的條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白；

b．用分子量為16.9kDa的條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白作為抗原免疫Balb/C小鼠；

c.??取小鼠脾臟與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過免疫印跡法、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫法和間接免疫熒光法，篩選分泌條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；

d．利用有限稀釋法克隆陽性雜交瘤細(xì)胞。

所述a步驟按如下方法進(jìn)行：

a.1取瀕死條石鯛的脾臟100mg，置于1.5ml的Eppendorf管中，在10℃條件下，按CTAB方法提取病毒DNA；

a.2根據(jù)質(zhì)粒pET-28a（+）酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物如下：

上游引物P1：5'-GAATTCATGT?ACCCTGACTGTCCCAG-3'；

下游引物P2：5'-GTCGACTTATTTCATAAGCCTTGCAC?A-3'；??

?PCR反應(yīng)總體系25μl，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5?min；94℃30?s，55℃30?s，72℃40?s，共30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸8min；

?PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定、產(chǎn)物回收純化后克隆入pMD-18T載體，然后轉(zhuǎn)化DH5α?感受態(tài)細(xì)胞；

a.3提取pMD-18T-ORF049L重組質(zhì)粒，然后用EcoR?I、Sal?I限制性內(nèi)切酶同時(shí)對重組質(zhì)粒pMD-18T-ORF049L及pET-28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，用T4?DNA連接酶將切膠回收的目的片段與pET-28a質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并挑選陽性克隆測序；將經(jīng)測序結(jié)果正確的pET28a-ORF049L質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于有Kan?30μg/ml抗體的LB篩選平板上；次日挑取轉(zhuǎn)化LB平板上長出的陽性菌落，于LB液體培養(yǎng)基（Kan?30μg/ml）中37℃活化過夜，然后按1：100（V/V）轉(zhuǎn)接于新鮮的LB液體培養(yǎng)基（Kan?30μg/ml）中，培養(yǎng)至OD₆₀₀值為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1?mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后的菌液15000?r/min離心l?min收集菌體；