[發明專利]條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體及其制備方法

無效

• 申請號: 201310218003.8
• 申請日: 2013-06-04
• 公開（公告）號: CN103288954A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 李強;王友娟;李華;葉仕根;孫志鵬
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學;李強
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

1.一種條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體，其特征在于：所述的單克隆抗體是由保藏號為CGMCC?No.7304的抗條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株所分泌，結合的抗原是分子量為16.9kDa的條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白。

2.一種如權利要求1所述條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于按如下步驟進行：

a.?通過基因克隆、原核表達獲得分子量為16.9kDa的條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白；

b．用分子量為16.9kDa的條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白作為抗原免疫Balb/C小鼠；

c.?取小鼠脾臟與骨髓瘤細胞進行細胞融合，經過免疫印跡法、斑點酶聯免疫法和間接免疫熒光法，篩選分泌條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞；

d．利用有限稀釋法克隆陽性雜交瘤細胞。

3.根據權利要求2所述條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述a步驟按如下方法進行：

a.1取瀕死條石鯛的脾臟100mg，置于1.5ml的Eppendorf管中，在10℃條件下，按CTAB方法提取病毒DNA；

a.2根據質粒pET-28a（+）酶切位點設計引物如下：

上游引物P1：5'-GAATTCATGT?ACCCTGACTGTCCCAG-3'；

下游引物P2：5'-GTCGACTTATTTCATAAGCCTTGCAC?A-3'；??

PCR反應總體系25μl，反應條件為：95℃預變性5?min；94℃30?s，55℃30?s，72℃40?s，共30個循環，72℃再延伸8min；

PCR產物經電泳鑒定、產物回收純化后克隆入pMD-18T載體，然后轉化DH5α?感受態細胞；

a.3提取pMD-18T-ORF049L重組質粒，然后用EcoR?I、Sal?I限制性內切酶同時對重組質粒pMD-18T-ORF049L及pET-28a質粒進行雙酶切，用T4?DNA連接酶將切膠回收的目的片段與pET-28a質粒連接后轉化于DH5α感受態細胞，并挑選陽性克隆測序；將經測序結果正確的pET28a-ORF049L質粒轉化BL21（DE3）感受態細胞，涂布于有Kan?30μg/ml抗體的LB篩選平板上；次日挑取轉化LB平板上長出的陽性菌落，于LB液體培養基（Kan?30μg/ml）中37℃活化過夜，然后按1：100（V/V）轉接于新鮮的LB液體培養基（Kan?30μg/ml）中，培養至OD₆₀₀值為0.6時，加入IPTG至終濃度為1?mmol/L，37℃繼續培養4h后的菌液15000?r/min離心l?min收集菌體；

a.4?菌體進行超聲破碎后，10000r/min，離心15min收集沉淀，然后用含變性劑的1×Bind?Buffer?(?500?mM?NaCl，20?mM?Tris-HCl，5mM咪唑，6M鹽酸胍，pH7.9?)冰上充分溶解，12000r/min，離心30min后上清用0.45μm微孔濾膜過濾；過濾后上清加入至已平衡好的Ni親和層析柱中，所得蛋白為分子量為16.9kDa的條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白。

4.根據權利要求3所述條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述c步驟按如下方法進行：在無菌條件下將免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞用45%?PEG1500融合，融合細胞用HAT選擇性培養液重懸，滴入加有飼養細胞的96孔細胞培養板中，每孔0.2ml，置于37℃，CO₂濃度為5%的培養箱中培養，兩周后，檢測雜交瘤細胞上清液，經過免疫印跡法、斑點酶聯免疫法和間接免疫熒光法，篩選分泌條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞。

5.根據權利要求4所述條石鯛虹彩病毒ORF049L重組蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述d步驟是采用有限稀釋法克隆陽性雜交瘤細胞：將陽性雜交瘤細胞用1640培養液重懸，10倍梯度稀釋至10²cells/ml，取1?ml細胞液加入9?ml培養液，混合均勻，滴入加有飼養細胞的96孔細胞培養板中，每孔0.1?ml，選取只有一個雜交瘤細胞的培養孔，待細胞長滿孔底2/3以上時，取上清液進行檢測。