[發(fā)明專利]PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒及方法和應用

有效

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• 申請日: 2013-06-03
• 公開（公告）號: CN104165997A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發(fā)明（設計）人: 童光志;周艷君;孫晶;姜一峰;童武
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 上海序倫律師事務所 31276
• 代理人: 周東萍

技術領域

本發(fā)明涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)檢測技術領域，具體涉及一種PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒及方法和應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的全球范圍內嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病。1987年首先在美國發(fā)現該病，我國1996年首次分離出PRRSV，但2006年高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)大范圍爆發(fā)，給我國養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失，疫苗免疫是目前防制PRRSV的主要手段，目前國內用于預防PRRSV的商品化疫苗主要有高致病性藍耳病滅活疫苗、經典的CH-1R弱毒疫苗、3種高致病性藍耳病弱毒疫苗以及國外的一些商品化弱毒疫苗等，上述眾多種類的PRRS疫苗在國內廣泛使用，疫苗的使用雖然可以控制PRRS的流行，同時也加大了對豬藍耳病病原感染鑒別診斷的難度。因此有必要研制新型標記疫苗以解決當前諸多疫苗并存使用以及高致病性PRRSV與經典PRRSV同時存在且難以區(qū)分的混亂局面。正是在此背景下，本實驗室在PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株感染性克隆的基礎上，利用反向遺傳操作技術，將新城疫病毒NP蛋白末端49個氨基酸(NP49)作為標記，插入Nsp2的復制非必須的缺失區(qū)域(Δ508-532)，成功構建雙標記基因工程弱毒疫苗株(rHN4-Δ25+NP49株)，而且通過實驗證實該基因標記疫苗株不僅對高致病性豬藍耳病病毒感染具有較好的免疫保護效果，同時由于疫苗株內部引入了標記基因，為實現對標記疫苗的鑒別診斷奠定了基礎。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決目前由于眾多種類PRRS疫苗的廣泛使用，加大了對豬藍耳病病原感染鑒別診斷難度的技術問題，提供一種PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒，該試劑盒以NP49作為診斷抗原，能有效區(qū)分傳統PRRS疫苗免疫與標記疫苗免疫豬的血清抗體，其靈敏度高、特異性強、重復性好。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現：

在本發(fā)明的一個方面，提供了一種PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒，所述試劑盒包含NP49多肽抗原，該NP49多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

所述試劑盒還包含ELISA酶標板、封閉液、血清稀釋液、酶標二抗、顯示液、終止液、標準陽性血清、標準陰性血清。

優(yōu)選的，NP49多肽抗原的包被濃度為500ng/孔。

優(yōu)選的，所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗豬抗體，其稀釋度為1∶10000。

所述標準陽性血清是用重組NDVNP49抗原蛋白免疫豬而制得，該重組NDVNP49抗原蛋白由包含NP49多肽編碼基因的重組表達載體經誘導表達、純化后制得。

優(yōu)選的，所述封閉液和血清稀釋液為2％重量濃度的牛血清白蛋白。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種非診斷目的的PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別方法，包括以下步驟：

用NP49多肽抗原包被ELISA酶標板；

將待測血清與包被抗原作用后，依次加入酶標二抗、顯色液和終止液；

利用酶標儀讀取吸光度值OD₄₅₀nm，并按公式：S/P＝(待測血清樣品OD-陰性對照OD)/(陽性對照OD-陰性對照OD)，計算待測血清樣品的S/P值；

待測血清樣品S/P值≥臨界值的判為陽性，S/P值＜臨界值的判為陰性，所述臨界值是通過ROC統計學分析方法獲得的當靈敏度和特異度數值之和最大時對應的S/P值。

所述待測血清的稀釋度為1∶40。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述試劑盒在制備鑒別診斷PRRS基因工程標記疫苗免疫豬的產品中的應用。

本發(fā)明PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒，采用特異性標記位段新城疫病毒NP蛋白末端49個氨基酸(NP49)多肽作為抗原，具有特異性強、靈敏度高、重復性好的特點，可快速、準確地區(qū)分傳統PRRS疫苗免疫與標記疫苗免疫豬的血清抗體，同時可快速、準確地鑒別診斷出PRRSV基因標記疫苗株與自然感染毒株，對于PRRS基因標記疫苗株的臨床廣泛應用具有重要意義。

附圖說明

下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明。

圖1是本發(fā)明實施例1的NDV?NP49基因原核表達載體的構建、表達、純化及抗原性分析結果圖；

圖2是本發(fā)明實施例2確定抗原最佳包被條件的結果圖；

圖3是本發(fā)明實施例2確定封閉液的結果圖；