[發明專利]一種用于以熒光RT-PCR檢測樣品中禽流感病毒的引物對、探針和包含其的試劑盒

有效

• 申請號: 201310216539.6
• 申請日: 2013-06-03
• 公開（公告）號: CN103320528A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 衛明;邱慶豐;陳勉喬;張宏斌;蘇祖妙
• 申請（專利權）人: 深圳太太基因工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 李渤;張偉

技術領域

本發明涉及一種用于檢測禽流感病毒、特別是H7型核苷酸片段的引物和探針序列，以及包含所述引物和探針序列的試劑盒。

背景技術

禽流感主要是指禽中流行的由流感病毒引起的感染性疾病。自2013年3月在上海、安徽兩地爆發以來，至2013年4月21日，我國共報告102例確診為禽流感H7N9的病例，其中死亡20人，12人康復，其余70人正在各定點醫療單位接受救治，涉及上海，江蘇，安徽、浙江等省市。針對疫情的不斷蔓延，國家衛生和計劃生育委員會迅速出臺了人感染H7N9禽流感診療方案，相關省市衛生主管部門也紛紛啟動疫情防控應急預案，力爭將疫情控制到最小范圍，最大限度地減輕疫情危害。

最新的對比研究發現，當前H7N9病毒的基因多樣性與之前在歐洲出現的同為H7亞型的禽流感病毒相當，這預示著病毒發生變異的能力較強，其未來可能的變異情況值得警惕。《歐洲監控》雜志日前在線刊登一項研究報告說，荷蘭國家公共衛生和環境研究所等機構研究人員與中國同行一起，分析了H7N9病毒毒株的基因數據，并與引發2003年荷蘭禽流感的H7N7病毒、引發1999年和2000年意大利禽流感的H7N1病毒進行了對比。結果發現，這三種H7型病毒的基因多樣性相當，因此新病毒可能也具有較強的變異能力。

針對禽流感H7型病毒的較強的變異性,在其保守的區設計了一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針,確保能夠準確測出禽流感H7型病毒,同時可以防止H7N9的進一步變異,導致無法及時檢測出陽性病毒,而推遲了治療時間,給人類的健康帶來生命危險。

而禽類特別是水禽是所有這些流感病毒的自然宿主，H7禽流感病毒是其中的一種。這個病毒的生物學特點、致病力、傳播力，到目前還沒有依據進行分析判斷。

目前常見的病毒分離和血清學診斷方法，操作繁瑣、耗時、敏感性低、特異性差，不適宜作為病毒的早期診斷。隨著分子生物學技術的發展，普通PCR方法已經廣泛應用于臨床診斷，但該技術需要對PCR產物進行后處理，極易導致PCR產物污染，同時有一定的非特異性擴增。而熒光PCR技術則是在普通PCR技術的基礎上，在擴增反應體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實時監測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術。除了具有普通PCR的優點外，它還具有以下優點：（1）特異性更強，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補配對的熒光探針，提高了特異性，并且由自動化儀器收集熒光信號，避免了人工判斷的主觀性，又可進一步提高靈敏度；（2）全封閉反應，在線式實時監測熒光，無須PCR產物的后處理，避免污染，保證了結果的可靠性；（3）數據分析選在核酸擴增的對數期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點分析法，使得定量更準確可靠；（4）可實現單管雙檢或多檢，還可設計針對性內標，監控抽提效率及排除抑制劑干擾；（5）不接觸有毒試劑，操作安全；（6）有利于規模化、自動化及聯網管理；（7）適用范圍更廣，理論上可檢測任何病毒的核酸。

目前針對禽流感病毒，還需要開發新的靈敏度高的熒光PCR檢測引物、探針以及相應的檢測產品，特別是H7通用型檢測產品。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測禽流感病毒核苷酸片段的引物和探針序列。

本發明的另一個目的是提供一種用于以熒光RT-PCR檢測樣品中禽流感病毒的試劑盒。

基于上述目的，本發明采用以下技術方案：

一方面，本發明提供一對核苷酸序列，其可用作檢測禽流感病毒的引物對，所述引物對由上游引物和下游引物組成，上游引物（本文中又稱為“H7N9-4.0-F”）包含SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，下游引物（本文中又稱為“H7N9-4.0-R”）包含SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列：

SEQ?ID?NO.1GGTTTAGCTTCGGGGCATC；

SEQ?ID?NO.2TATATACAAATAGTGCACCGCATGT。

優選地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

另一方面，本發明提供一個核苷酸序列，其可用作檢測禽流感病毒的探針，所述探針（本文中又稱為“H7N9-4.0-B”）包含SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列：

SEQ?ID?NO.3TTATGCAAATGAAAACCAATCCCATTG。

優選地，所述探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。