[發(fā)明專利]一種用于以熒光RT-PCR檢測樣品中禽流感病毒的引物對、探針和包含其的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310216539.6
• 申請日: 2013-06-03
• 公開（公告）號(hào): CN103320528A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 衛(wèi)明;邱慶豐;陳勉喬;張宏斌;蘇祖妙
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳太太基因工程有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京瑞恒信達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11382
• 代理人: 李渤;張偉

1.一種用于檢測禽流感病毒的引物對，所述引物對由上游引物和下游引物組成，其特征在于，所述上游引物包含SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物包含SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列：

SEQ?ID?NO.1GGTTTAGCTTCGGGGCATC；

SEQ?ID?NO.2TATATACAAATAGTGCACCGCATGT。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

3.一種用于檢測禽流感病毒的探針，其特征在于，所述探針包含SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列：

SEQ?ID?NO.3TTATGCAAATGAAAACCAATCCCATTG。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的探針，其特征在于，所述探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的探針，其特征在于，所述探針的3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，所述熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1或TAMRA，優(yōu)選BHQ1；所述探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM或ROX，優(yōu)選FAM。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物對或者根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于，所述禽流感病毒為H7型，優(yōu)選H7N9亞型。

7.一種用于以熒光RT-PCR檢測樣品中禽流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

（1）根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物對；

（2）根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的探針；

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括：

（3）dNTPs；

（4）PCR反應(yīng)緩沖液；

（5）Mg²⁺；

（6）Taq酶；

（7）反轉(zhuǎn)錄酶；

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述試劑盒還包括：

（8）禽流感病毒RNA提取液，為Trizol?Reagent總RNA提取試劑；

（9）陰性質(zhì)控品，為水，優(yōu)選為DEPC水；和

（10）陽性質(zhì)控品，為滅活毒株，優(yōu)選為H7N9滅活毒株。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，在采用所述試劑盒進(jìn)行禽流感病毒檢測時(shí)，RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系以25μl計(jì)包含：

（1）根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物對的上游引物和下游引物各0.2μmol/L；

（2）根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的探針0.1μmol/L；

（3）dNTPs0.2mmol/L；

（4）PCR反應(yīng)緩沖液，終濃度1×；

（5）Mg²⁺2.5mmol/L；

（6）Taq酶2U；

（7）反轉(zhuǎn)錄酶4U；和

（8）水，優(yōu)選為DEPC水，在加入RNA模板后補(bǔ)至25μl。

9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述禽流感病毒為H7型，優(yōu)選H7N9亞型。

10.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR的反應(yīng)條件為：

50℃20分鐘；然后是：95℃3分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃5秒，60℃40秒，40個(gè)循環(huán)。

11.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品為來自禽類或哺乳動(dòng)物的咽喉拭子、泄殖腔拭子、組織樣本、血清或血漿。