[發明專利]一種血漿中功能性蛋白質的分離純化方法

有效

• 申請號: 201310216023.1
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103288953A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 董悅生;李玲玲;于芳;修志龍
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K16/06;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/14
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種蛋白質的分離純化方法，尤其涉及一種分離純化血漿中功能性蛋白質的方法。

背景技術

血漿由90%的水、7%的蛋白以及3%的糖類有機物組成，這7%的蛋白包含了數百個具有廣泛生理功能的蛋白質，使得血漿成為了大多治療產品或生物藥物的分餾產品的原材料，從血漿中分離提取得到的功能性蛋白質包括白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子類（纖維蛋白、原凝血因子VIII）、蛋白抑制劑類等品種。其中白蛋白含量最高，占其總量的一半以上，為單鏈、非糖基化蛋白，主要參與維持滲透壓、運輸物質脂肪酸及協助人體解毒等功能。白蛋白的血液制品是目前應用最為廣泛的血漿蛋白制品，臨床上主要用于失血性休克、低蛋白血癥等疾病的治療。免疫球蛋白在血液中的豐富程度僅次于白蛋白，達到了蛋白總量的15%，以免疫球蛋白G最為重要，主要參與高等生物的體液免疫，保護機體免受病原體等抗原的侵害，在體內，免疫球蛋白具有與病原體或毒素結合，活化補體，強化吞噬殺傷效應，產生過敏反應及減緩器官移植中的排斥反應等生物學功能，是人和動物體內抗感染的主力效應分子，并具有治療癲癇癥、抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞早期凋亡的作用，應用領域十分廣泛。

表1.一些主要人血漿功能性蛋白質

目前，血漿中功能性蛋白質的分離純化方法主要采用Cohn氏低溫乙醇沉淀法，該方法在二戰期間有Cohn等人發明，隨后由Kistler和Nitschmann等人進行改進，該方法主要通過在低溫條件下（-7-5℃），向血清中分步添加不同濃度（8-25%）的乙醇，使IgG、白蛋白等分步沉淀，再用離心的方法收集血漿蛋白中的功能性蛋白質。該方法具有易于工業化的優點，但在實際應用中也存在著諸多的問題，首先，該方法需要在低溫環境下操作，并且需要對溫度控制的精度要求較高、設備投入大，能耗大；其次，該方法操作步驟繁瑣、收率低、純度低，需要多步沉淀和離心，造成血漿蛋白中功能蛋白質的大量損失。研究表明，僅IgG的損失就達到50%，經過該方法分離得到的血漿功能性蛋白質的純度也無法滿足臨床的需要。近年來許多研究者嘗試新的分離方法，中國專利授權公開號CN1281617C公開了一種采用壓濾工藝分離血漿蛋白的方法，可以提高血漿蛋白的收率，但仍需采用分步沉淀的方法，且未提及用該方法獲得的血漿蛋白純度。中國專利授權公告號CN1259338C公開了一種可在密封的管道內進行血漿蛋白分離方法，該方法對Cohn法進行了改進，采用壓濾替代Cohn法中固液分離部分的離心操作，生產周期可以縮短一半，但仍然未克服Cohn法存在的問題。WO9805685A1公開了一種采用大孔陰離子交換介質純化血漿中功能性蛋白質的方法，可以避免多步沉淀和離心，但IgG的純度只有36-66%。中國專利授權公告號CN1089609C公開了一種采用親和層析獲得高純度IgG的方法，但親和介質的高成本，限制著該方法的應用。

血漿蛋白成分復雜，而且存在著HIV、HBV等病毒的殘留，使血漿功能性蛋白質對使用者的健康存在潛在的威脅，迫切需要發現成本低、操作簡便、收率高的高純度血漿功能性蛋白質的制備方法。

雙水相萃取技術出現于20世紀60年代，最早的研究是基于兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽，如聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/無機鹽，在一定濃度下的分子空間阻礙作用，而形成不互溶的兩水相。Vargas等發現由聚乙二醇/磷酸鉀、氯化鈉組成的雙水相體系可以分離IgG和白蛋白（Biotechnology?progress,2012,28,1005-1011)，但該方法中水溶性高聚物黏度大，需要反萃取，后續分離步驟繁瑣,而且價格昂貴的高聚物回收困難，分離成本高昂（食品工業科技，2007，28，235～238）。WO2013039449公開了一種使用EOPO聚合物分相后采用多元酸聚合物沉淀的血漿蛋白的方法，可以在常溫下分離血漿功能性蛋白質，但依然存在成本高、步驟繁瑣等缺點。由親水性有機溶劑和鹽形成的雙水相，可以萃取金屬絡合物，中藥有效成分和低分子二元醇等（天然產物研究與開發，2002，21(3):75～77；《分析測試學報》，2006，18，647～649；CN101012151A；CN101012152A），是一種新的提取分離方法。本申請的部分發明人提交過兩件中國發明專利申請（CN101481403和CN102070714A），用這種雙水相體系萃取酵母發酵液中重組人血清白蛋白。但與酵母發酵液相比，血漿不僅形狀差別大，而且其中蛋白質的種類、含量也差別巨大。如何從血漿中快速、有效地分離純化獲得高純度功能性蛋白質，成為目前研究的重點及難點。

發明內容