[發明專利]一種家蠶質型多角體病毒RT-LAMP檢測用引物組及檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310215962.4
• 申請日: 2013-06-03
• 公開（公告）號: CN103397104A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 劉吉平;楊吉龍
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

1.一種通過環介導等溫擴增技術檢測家蠶質型多角體病毒的引物組，其特征在于，所述引物組包括一對內側引物CPVFI2/CPVBI2和一對外側引物CPVF2/CPVB2，CPVF2、CPVB2、CPVFI2和CPVBI2引物的序列如SEQ?ID?NO：1~4所示。

2.一種家蠶質型多角體病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括一對內側引物CPVFI2/CPVBI2和一對外側引物CPVF2/CPVB2，CPVF2、CPVB2、CPVFI2和CPVBI2引物序列如SEQ?ID?NO:1~4所示。

3.根據權利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含Bst?DNA?聚合酶、反應液、穩定液、顯色液和陽性對照液；所述反應液的配方為：每1L反應液中含有35~45?mM?pH?8.8的?Tris-HCl、15~25?mM?氯化鉀、15~20?mM硫酸鎂、15~20?mM硫酸銨、0.15~0.25%?Tween?20、2.5~3.0?mM?dNTPs和1.5~1.8?M?甜菜堿。

4..根據權利要求3所述試劑盒，其特征在于，所述反應液的配方為：每1L反應液中含有40?mM?pH?8.8?的Tris-HCl、20?mM氯化鉀、16?mM硫酸鎂、20?mM硫酸銨、0.2%Tween?20、2.8?mM?dNTPs和1.6?M?甜菜堿。

5.根據權利要求3所述試劑盒，其特征在于，所述穩定液為甘油；所述的顯色液為SYBR?Green?I或EvaGreen；所述陽性對照液為含有家蠶質型多角體病毒基因組第5片段核苷酸部分序列的重組質粒。

6.根據權利要求2或3所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的反應體系為：

25?μL?RT-LAMP反應體系為：

反應液????????????????????????12.5μL；

5pmol/μL??CPVF2/CPVB2????????0.5μL?；

40pmol/μL?CPVFI2/CPVBI2???????1μL?；

8U?Bst?DNA?polymerase??????????0.8?μL?；

10U逆轉錄酶??????????????????0.2μL；

?RNA?????????????????????????2?μL；

DEPC水??????????????????????補充至25μL；

所述反應條件為：60℃~65℃水浴40~60?min；最后80~95℃，滅活2~10?min。

7.根據權利要求6所述試劑盒，其特征在于，所述反應條件為：63℃水浴60?min；90℃，滅活2?min。

8.一種利用權利要求1至7任一項所述試劑盒檢測家蠶質型多角體病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟：

????S1.提取待測樣品RNA；

????S2.配置RT-LAMP反應體系；向反應體系中加入穩定液進行RT-LAMP反應；

S5.反應結束后，向反應產物中加入顯色液進行染色檢測，顯色為綠色判斷結果為陽性，顯色為橙色判斷結果為陰性。