[發(fā)明專利]H7N9禽流感病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310215952.0
• 申請(qǐng)日: 2013-06-03
• 公開（公告）號(hào): CN103255236A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝芝勛;羅思思;劉加波;龐耀珊;鄧顯文;謝志勤;謝麗基;范晴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于RT-PCR檢測(cè)試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種H7N9禽流感病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

禽流感病毒（Avian?Influenza?Virus，AIV）屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，為單股負(fù)鏈RNA，多形態(tài)的有囊膜病毒。禽流感病毒的基因組分為8個(gè)節(jié)段，分別編碼HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白，病毒囊膜上的纖突，分別具有血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的活性。這兩個(gè)基因是病毒的特異性抗原，根據(jù)HA和NA蛋白抗原性不同，目前可分為16個(gè)H亞型（H1-H16）和9個(gè)N亞型（N1-N9）。

由于禽流感病毒其基因組呈節(jié)段復(fù)制，通過依賴RNA聚合酶完成復(fù)制，而RNA聚合酶缺乏校正功能，所以禽流感病毒發(fā)生基因突變的頻率極高。自2013年2月以來，華東地區(qū)上海市、安徽省、江蘇省、浙江省先后發(fā)生不明原因重癥肺炎病例，于3月31日將其確診為人感染H7N9禽流感病毒。這是首次發(fā)現(xiàn)H7N9禽流感病毒感染人的病例，目前，急需建立H7N9禽流感病毒的快速檢測(cè)方法和研發(fā)相應(yīng)試劑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種敏感性好、特異性高、快速方便的H7N9禽流感病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)試劑盒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：H7N9禽流感病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)試劑盒，包括引物組和探針組；引物組有引物1至4，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的堿基序列；探針組有探針A和探針B，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的堿基序列。

探針A的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記有淬滅熒光染料Eclipse；探針B的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料ROX，3’端標(biāo)記有淬滅熒光染料Eclipse。

引物1、引物2、探針A、引物3、引物4和探針B的摩爾比為1：1：2：1：1：1。

上述H7N9禽流感病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、PCR反應(yīng)液、DEPC水和超純水；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液每管16μL，含有5×Reverse?Transcriptase?Buffer?10μL、50pmol9mer?Random?Primer2μL、10mM?dNTP?Mixture2μL、40U?Ribonuclease?Inhibitor1μL和5U/μL?AMV?Reverse?Transcriptase1μL；PCR反應(yīng)液每管11.4μL，含有2×Premix?Ex?Taq10μL，20μM?H7亞型禽流感病毒正向、反向引物和TaqMan探針分別0.2μL、0.2μL、0.4μL，20μM?N9亞型禽流感病毒正向、反向引物和TaqMan探針各0.2μL；DEPC水和超純水各1mL。

發(fā)明人針對(duì)H7亞型禽流感病毒HA基因和N9亞型禽流感病毒NA基因保守序列，通過Primer?Express3.0軟件，設(shè)計(jì)了多套探針和引物，通過分析其特異性和引物之間的二聚體，篩選出了2套熒光TaqMan探針和引物，構(gòu)成專門針對(duì)H7亞型和N9亞型禽流感病毒的引物組和探針組，組合成二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)試劑盒，既可確定單個(gè)H7亞型或N9亞型禽流感病毒感染，也可一管檢測(cè)即可確定是否為H7N9禽流感病毒感染，且相互間沒有干擾，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的敏感性和特異性。本發(fā)明在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上添加了一條標(biāo)記兩個(gè)熒光染料基團(tuán)的核苷酸探針，報(bào)告熒光染料在探針的5’端，淬滅熒光染料標(biāo)記在探針的3’端，二者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告熒光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅熒光染料吸收，在熒光定量RT-PCR反應(yīng)的退火過程中，探針優(yōu)先結(jié)合到DNA模板上，當(dāng)引物延伸到探針結(jié)合位置時(shí)，在DNA聚合酶5’端到3’端的外切酶的作用下，探針被水解，從而導(dǎo)致報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)距離變遠(yuǎn)，報(bào)告熒光信號(hào)得以釋放出來而被儀器檢測(cè)到，反應(yīng)結(jié)果可以直接通過電腦實(shí)時(shí)觀察，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)H7N9禽流感病毒的快速檢測(cè)，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判定H7N9禽流感病毒感染，同時(shí)還可確定H7亞型禽流感病毒、N9亞型禽流感病毒感染，根據(jù)本發(fā)明建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，還可確定待檢樣品中H7N9禽流感病毒拷貝數(shù)。

實(shí)驗(yàn)證明，一方面，本發(fā)明及其檢測(cè)方法充分利用了PCR技術(shù)的高擴(kuò)增性、良好的特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速敏感性，反應(yīng)結(jié)束即時(shí)便可根據(jù)擴(kuò)增曲線判定是否為H7N9禽流感病毒感染；另一方面，若非H7N9禽流感病毒感染，還可確定是否是H7亞型禽流感病毒或N9亞型禽流感病毒感染。

附圖說明