[發(fā)明專利]測(cè)定胰島中A細(xì)胞與B細(xì)胞數(shù)目比例的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310215727.7
• 申請(qǐng)日: 2013-05-31
• 公開（公告）號(hào): CN103267752A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳良怡;王意
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 北京超凡志成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 李世喆

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及測(cè)定胰島中A細(xì)胞與B細(xì)胞數(shù)目比例的方法。

背景技術(shù)

胰島中包含A細(xì)胞、B細(xì)胞、D細(xì)胞及PP細(xì)胞等多種細(xì)胞。其中，A細(xì)胞與B細(xì)胞的比例對(duì)人體糖代謝的調(diào)節(jié)起重要作用。

相關(guān)技術(shù)中，測(cè)定胰島中A細(xì)胞與B細(xì)胞數(shù)目比例的方法通常是：先將胰島細(xì)胞團(tuán)用多聚甲醛（PFA）進(jìn)行固定，包埋和切片，再加入胰島素的第一抗體和胰高血糖素的第一抗體，最后加入分別匹配以上兩種抗體的不同第二抗體（分別被不同的熒光物質(zhì)標(biāo)記），最終通過測(cè)量有熒光部分的面積計(jì)算得到A細(xì)胞與B細(xì)胞的比例。

但是，這種方法的缺點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞造成了損壞：在進(jìn)行免疫反應(yīng)前要將胰島細(xì)胞固定，改變了其細(xì)胞形態(tài)，使得細(xì)胞死亡而無(wú)法進(jìn)行其它活細(xì)胞功能檢測(cè)試驗(yàn)，例如探測(cè)細(xì)胞的分泌功能等等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供測(cè)定胰島中A細(xì)胞與B細(xì)胞數(shù)目比例的方法，以解決上述的問題。

在本發(fā)明的實(shí)施例中提供了一種測(cè)定胰島中A細(xì)胞與B細(xì)胞數(shù)目比例的方法，包括下列步驟：

步驟A：從待測(cè)胰島細(xì)胞團(tuán)中取出一部分，從中分離出多個(gè)A細(xì)胞和多個(gè)B細(xì)胞；

步驟B：分別統(tǒng)計(jì)所述A細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目m和所述B細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目n；分別測(cè)量所述m個(gè)A細(xì)胞的總面積S₁和所述n個(gè)B細(xì)胞的總面積S₂；

步驟C：向胰島培養(yǎng)基中加入鋅離子熒光染料，再將所述m個(gè)A細(xì)胞置于該培養(yǎng)基中，培養(yǎng)；后檢測(cè)所述m個(gè)A細(xì)胞熒光淬滅前的平均熒光值a₁；向所述胰島培養(yǎng)基中加入非熒光素鋅離子絡(luò)合劑，靜置后檢測(cè)所述m個(gè)A細(xì)胞熒光淬滅后的平均熒光值b₁;

步驟D：向胰島培養(yǎng)基中加入鋅離子熒光染料，再將所述n個(gè)B細(xì)胞置于該培養(yǎng)基中，培養(yǎng)；后檢測(cè)所述n個(gè)B細(xì)胞熒光淬滅前的平均熒光值a₂；向所述胰島培養(yǎng)基中加入非熒光素鋅離子絡(luò)合劑，靜置后檢測(cè)所述n個(gè)B細(xì)胞熒光淬滅后的平均熒光值b₂;

步驟E：再?gòu)拇郎y(cè)胰島細(xì)胞團(tuán)中取出一部分胰島細(xì)胞團(tuán)作為檢測(cè)樣本；向胰島培養(yǎng)基中加入鋅離子熒光染料，再將所述檢測(cè)樣本置于該培養(yǎng)基中，培養(yǎng)；后檢測(cè)所述檢測(cè)樣本熒光淬滅前的熒光值a；向所述胰島培養(yǎng)基中加入非熒光素鋅離子絡(luò)合劑，靜置后檢測(cè)所述檢測(cè)樣本熒光淬滅后的熒光值b;

步驟F：根據(jù)下列公式得到待測(cè)胰島細(xì)胞團(tuán)中A細(xì)胞與B細(xì)胞的數(shù)目比例R：

R=b2a-ba2ba1-ab1×mS2nS1;]]>

其中，所述鋅離子熒光染料為對(duì)所述A細(xì)胞和所述B細(xì)胞熒光染色能力不同，并且具有膜滲透性的鋅離子熒光染料；

操作所述步驟A至所述步驟E時(shí)的環(huán)境溫度為16-37℃。

本發(fā)明上述實(shí)施例的方法的檢測(cè)原理是：先后分別采用鋅離子熒光染料和非熒光素鋅離子絡(luò)合劑與活細(xì)胞中的鋅離子絡(luò)合，鋅離子熒光染料作為熒光激發(fā)劑，非熒光素鋅離子絡(luò)合劑作為熒光淬滅劑，使得細(xì)胞發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，再根據(jù)細(xì)胞熒光淬滅前后的熒光值計(jì)算得到胰島中A細(xì)胞與B細(xì)胞的比例；該熒光淬滅的原理是：

以A細(xì)胞為例，在用于培養(yǎng)胰島細(xì)胞的胰島培養(yǎng)基中加入一種能發(fā)射熒光的絡(luò)合劑—鋅離子熒光染料，該鋅離子熒光染料選擇性地與m個(gè)A細(xì)胞中的鋅離子絡(luò)合，從而使得m個(gè)A細(xì)胞發(fā)射熒光；接著向所述胰島培養(yǎng)基中加入另一種絡(luò)合劑—非熒光素鋅離子絡(luò)合劑，此時(shí)非熒光素鋅離子絡(luò)合劑與鋅離子熒光染料競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞中的鋅離子，使得鋅離子熒光染料與鋅離子的絡(luò)合產(chǎn)物部分解離，進(jìn)而使得m個(gè)A細(xì)胞發(fā)射的熒光強(qiáng)度降低，產(chǎn)生熒光淬滅，同時(shí)在此過程中檢測(cè)m個(gè)A細(xì)胞發(fā)生熒光淬滅前、淬滅后的平均熒光值；