[發明專利]測定胰島中A細胞與B細胞數目比例的方法

有效

• 申請號: 201310215727.7
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103267752A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發明（設計）人: 陳良怡;王意
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 李世喆

1.測定胰島中A細胞與B細胞數目比例的方法，其特征在于，包括下列步驟：

步驟A：從待測胰島細胞團中取出一部分，從中分離出多個A細胞和多個B細胞；

步驟B：分別統計所述A細胞的細胞數目m和所述B細胞的細胞數目n；分別測量所述m個A細胞的總面積S₁和所述n個B細胞的總面積S₂；

步驟C：向胰島培養基中加入鋅離子熒光染料，再將所述m個A細胞置于該培養基中，培養；后檢測所述m個A細胞熒光淬滅前的平均熒光值a₁；向所述胰島培養基中加入非熒光素鋅離子絡合劑，靜置后檢測所述m個A細胞熒光淬滅后的平均熒光值b₁;

步驟D：向胰島培養基中加入鋅離子熒光染料，再將所述n個B細胞置于該培養基中，培養；后檢測所述n個B細胞熒光淬滅前的平均熒光值a₂；向所述胰島培養基中加入非熒光素鋅離子絡合劑，靜置后檢測所述n個B細胞熒光淬滅后的平均熒光值b₂;

步驟E：再從待測胰島細胞團中取出一部分胰島細胞團作為檢測樣本；向胰島培養基中加入鋅離子熒光染料，再將所述檢測樣本置于該培養基中，培養；后檢測所述檢測樣本熒光淬滅前的熒光值a；向所述胰島培養基中加入非熒光素鋅離子絡合劑，靜置后檢測所述檢測樣本熒光淬滅后的熒光值b;

步驟F：根據下列公式得到待測胰島細胞團中A細胞與B細胞的數目比例R：

R=b2a-ba2ba1-ab1×mS2nS1;]]>

其中，所述鋅離子熒光染料為對所述A細胞和所述B細胞熒光染色能力不同，并且具有膜滲透性的鋅離子熒光染料；

操作所述步驟A至所述步驟E時的環境溫度為16-37℃。如權利要求1所述的測定胰島中A細胞與B細胞數目比例的方法，其特征在于，所述鋅離子熒光染料為紅色內酰胺鋅離子染料。

如權利要求2所述的測定胰島中A細胞與B細胞數目比例的方法，其特征在于，所述非熒光素鋅離子絡合劑為N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺。

如權利要求3所述的測定胰島中A細胞與B細胞數目比例的方法，其特征在于，

所述步驟C至所述步驟E中加入的紅色內酰胺鋅離子染料的濃度為：8-12μmol/L；

所述步驟C至所述步驟E中加入的N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺的濃度為：0.8-1.2mmol/L。

如權利要求4所述的測定胰島中A細胞與B細胞數目比例的方法，其特征在于，

所述步驟C至所述步驟E中所述培養的時間為0.8-1.2h；

所述步驟C至所述步驟E中所述靜置的時間為15-25min。如權利要求5所述的測定胰島中A細胞與B細胞數目比例的方法，其特征在于，

所述步驟C至所述步驟E中加入的紅色內酰胺鋅離子染料的濃度為：10μmol/L；

所述步驟C至所述步驟E中加入的熒光素鋅離子絡合劑為N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺的濃度為：1mmol/L；

所述步驟C至所述步驟E中所述培養的時間為1h；

所述步驟C至所述步驟E中所述靜置的時間為20min。

如權利要求1-6任一項所述的測定胰島中A細胞與B細胞數目比例的方法，其特征在于，所述胰島培養基為洛斯維·帕克紀念研究所RPMI培養基，且所述培養基含有0.1g/mL小牛血清。

如權利要求1-6任一項所述的測定胰島中A細胞與B細胞數目比例的方法，其特征在于，所述步驟C至所述步驟E中檢測熒光值的方法為：

采用寬場顯微鏡檢測或共聚焦顯微鏡檢測。

如權利要求1-6任一項所述的測定胰島中A細胞與B細胞數目比例的方法，其特征在于，操作所述步驟A至所述步驟E時的環境溫度為25-37℃。

如權利要求9所述的測定胰島中A細胞與B細胞數目比例的方法，其特征在于，所述m≥6；所述n≥6。