[發明專利]一種棒狀桿菌基因連續敲除系統及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 201310215508.9
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103409446A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 王小元;胡瑾瑜;李顏顏;譚延振;李燁
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N15/09;C12N1/20;C12R1/13;C12R1/15
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種棒狀桿菌基因連續敲除系統及其構建方法和應用，特別是一種基于同源重組與特異位點重組相結合的敲除系統，屬于微生物基因工程領域。

背景技術

棒狀桿菌是一類革蘭氏陽性菌，屬于具有中度到高GC含量的放線菌。自人們首次分離谷氨酸棒狀桿菌生產L-谷氨酸以來（Kinoshita?et?al.,1985），棒狀桿菌的三個主要代表：谷氨酸棒狀桿菌，黃色短桿菌，和乳糖發酵短桿菌，已經被廣泛用于生產氨基酸。

由于已累計了大量的關于谷氨酸棒狀桿菌生理學，生物化學和遺傳學知識（Eggeling?and?Bott，2005;Burkovski，2008），代謝工程已經取代經典的隨機突變，成為棒狀桿菌菌種改良的主要策略。隨著谷氨酸棒狀桿菌全基因組的測序，基因工程手段在代謝工程育種中地位越來越重要。利用分子生物學手段進行代謝工程育種，首先是需要有合適的載體。目前，隨著谷氨酸棒狀桿菌內源質粒包括pCG1（Ozaki，1984）、pBL1（Santamaria，1984）等家族的質粒的發現，研究者已經構建出大量用于進行基因表達的質粒（Xu，2010）。但是，另外一類質粒，用于染色體基因修飾的載體卻顯得很匱乏。目前應用廣泛的棒狀桿菌敲除載體為pK18mobsacB/pK19mobsacB。但其由于sacB基因的插入失活有時會給第二輪交換篩選帶來很大麻煩。當sacB基因處于谷氨酸棒狀桿菌亞種C.glutamicum?ATCC14067染色體上時，不具有蔗糖敏感性，所以對于C.glutamicum?ATCC14067需構建一套合適的敲除系統。

在本發明中，我們首先構建了一種基于同源重組與特異位點重組相結合的敲除系統。同源重組主要是依賴于片段或是載體與目標基因組存在一定相同的同源DNA序列，經過同源區的配對和鏈斷裂、再接產生交換，完成DNA重組。同源重組是最基本的重組方式，可以發生在任何一個菌株中，其中，同源片段越長越利于發生重組。在基因工程中，在抗性基因兩側添加目的基因兩側DNA片段作為同源臂，通過同源重組，目的基因由于兩側同源臂的重組交換而被抗性基因替代。特異位點重組利用Cre/lox特異重組系統。Cre/lox重組系統發現于P1噬菌體，包括重組酶和重組位點兩部分，其中，Cre是隸屬于λInt酶超基因家族的重組酶，可以接到重組位點間的基因序列被刪除或重組；loxp位點是可供Cre重組酶識別作用的重組位點，當兩個loxp位點位于一條DNA鏈上并且方向相同時，Cre重組酶能切除兩個loxp位點間的序列。loxL/loxR為突變loxp位點，兩個重組位點經過Cre酶重組后，產生一個不能再被Cre重組酶識別的位點loxLR，該位點不再參與位點重組。

本發明構建的敲除系統即利用同源重組及變異loxLR位點,用于擴增兩端含有克服現有敲除系統的缺陷，可用于棒狀桿菌主要亞種的基因敲除；敲除過程首先通過同源重組以Km抗性基因kan置換目的基因，然后通過位點特異重組去除基因組上抗性基因，操作簡便高效；可用于同一菌株中多個基因連續敲除；敲除完成后被改造菌株不攜帶任何抗性。

發明內容

本發明提供了一種棒狀桿菌基因連續敲除系統及其構建方法，通過此敲除系統1）成功敲除棒狀桿菌三個代表：谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032，黃色短桿菌ATCC14067，和乳糖發酵短桿菌ATCC13869中aceE；2）完成黃色短桿菌ATCC14067中aceE及ilvA的連續敲除。

本發明提供的棒狀桿菌基因連續敲除系統，包括模板質粒及溫敏表達質粒；所述模板質粒提供兩端帶有loxp或變異loxL/R位點的kan片段，又稱kan盒；所述溫敏表達質粒攜帶Cm抗性基因cat及溫敏C.glutamicum復制子，表達Cre重組酶，用于去除Km抗性基因kan。所述模板質粒為pDTW201/202；所述溫敏表達質粒為pDTW109；其核苷酸序列如SEQ?IDNO.1-NO.3所示。

棒狀桿菌基因連續敲除系統構建方案為：

第一步：以pK18mobsacB（Schafer?et?al.,1994）為模板，以kan-F/kan-R引物對作為模板，PCR擴增得到kan基因，并在其兩端分別引入XhoI和XbaI酶切位點，經過酶切純化后，備用；將人工合成的loxp位點序列loxp-F-F/loxp-F-R和loxp-R-F/loxp-R-R分別退火，形成雙鏈，備用；將人工合成的loxL/R位點序列loxL-F/loxL-R和loxR-F/loxR-R分別退火，形成雙鏈，備用;