[發(fā)明專利]一種棒狀桿菌基因連續(xù)敲除系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310215508.9
• 申請(qǐng)日: 2013-05-31
• 公開（公告）號(hào): CN103409446A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王小元;胡瑾瑜;李顏顏;譚延振;李燁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/66;C12N15/09;C12N1/20;C12R1/13;C12R1/15
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種棒狀桿菌基因連續(xù)敲除系統(tǒng)，其特征在于包括模板質(zhì)粒及溫敏表達(dá)質(zhì)粒；所述模板質(zhì)粒提供兩端帶有l(wèi)oxp或變異loxL/R位點(diǎn)的kan片段，又稱kan盒；所述溫敏表達(dá)質(zhì)粒攜帶Cm抗性基因cat及溫敏C.glutamicum復(fù)制子，表達(dá)Cre重組酶，用于去除Km抗性基因kan。

2.權(quán)利要求1所述的敲除系統(tǒng)，其特征在于所述模板質(zhì)粒為pDTW201/202。

3.權(quán)利要求1所述的敲除系統(tǒng)，其特征在于所述溫敏表達(dá)質(zhì)粒為pDTW109。

4.權(quán)利要求1-3任一所述敲除系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟：

第一步：以pK18mobsacB為模板，PCR擴(kuò)增得到kan基因，并在其兩端分別引入XhoI和XbaI酶切位點(diǎn)，經(jīng)過酶切純化后，備用；將人工合成的loxp片段loxp-F-F/loxp-F-R和loxp-R-F/loxp-R-R分別退火，形成雙鏈，備用；將人工合成的loxL/R片段loxL-F/loxL-R和loxR-F/loxR-R分別退火，形成雙鏈，備用;

第二步：將第一步處理好的kan片段、loxp片段和經(jīng)過ApaI和SacII酶切純化的pBluescript?II?SK(+)質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化JM109，新質(zhì)粒命名為pDTW201；以loxL和loxR片段代替兩段loxp片段，依照pDTW201的構(gòu)建方法，構(gòu)建的kan盒模板質(zhì)粒命名為pDTW202；

第三步：以pACYC184為模板，以相應(yīng)引物擴(kuò)增氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶Cat可移閱讀框，并在擴(kuò)增片段的5′和3′末端引入NheI和HindIII酶切位點(diǎn)；片段經(jīng)過NheI和HindIII酶切純化后與經(jīng)過同樣處理的pDXW-10連接形成pDXW-10-cat，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；以E.coli質(zhì)粒pKK223-3為模板，以相應(yīng)引物擴(kuò)增E.coli復(fù)制子oriE，片段5′和3′末端均引入SmaI限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)；以pDXW-10-cat為模板，以相應(yīng)引物擴(kuò)增氯霉素抗性基因，片段5′和3′末端引入SmaI切點(diǎn)；兩個(gè)片段均經(jīng)過SmaI酶切純化后連接，轉(zhuǎn)化JM109，新質(zhì)粒定名為pDTW-101；將質(zhì)粒pDTW-101和人工合成的MCS用HindIII和NheI酶切后純化，連接，轉(zhuǎn)化JM109；新的質(zhì)粒定名為pDTW102；

第四步：以含有C.glutamicum?pBL1復(fù)制子的pC2質(zhì)粒作為模板，以相應(yīng)引物擴(kuò)增C.glutamicum復(fù)制子rep，并在擴(kuò)增片段的5′和3′末端引入HindIII和SacII酶切位點(diǎn)；片段經(jīng)過HindIII和SacII酶切純化后與經(jīng)過同樣處理的pDTW102連接，轉(zhuǎn)化JM109，新的質(zhì)粒定名為pDTW104；

第五步：使用相應(yīng)引物對(duì)質(zhì)粒pDTW104進(jìn)行點(diǎn)突變，使C.glutamicum/pDTW104具有溫敏特性；新的具有溫敏特性的質(zhì)粒定名為pDTW106；

第六步：在pDTW106上再引入一個(gè)MCS序列，彌補(bǔ)之前操作導(dǎo)致的酶切位點(diǎn)消耗；使用寡核苷酸鏈進(jìn)行退火，與經(jīng)過SacI和SacII酶切純化處理的pDTW106連接，轉(zhuǎn)化JM109，新質(zhì)粒定名為pDTW107；

第七步：引入tac啟動(dòng)子；采用寡核苷酸鏈進(jìn)行退火形成雙鏈，與經(jīng)過BglII和SacII酶切純化處理的pDTW107連接，轉(zhuǎn)化JM109，新質(zhì)粒定名為pDTW108；

第八步：以pSH47為模板質(zhì)粒，以相應(yīng)引物擴(kuò)增重組酶片段，片段5′和3′末端引入XhoI和PstI酶切位點(diǎn)；重組酶片段經(jīng)過XhoI和PstI酶切純化與經(jīng)過同樣處理的pDTW108質(zhì)粒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化JM109，新質(zhì)粒定名為pDTW109。

5.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述pDTW201所含的kan盒模板核苷酸序列如SEQ?IDNO.1所示。

6.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述pDTW202所含kan盒模板核苷酸序列如SEQ?IDNO.2所示。

7.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述溫敏Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒pDTW109核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

8.權(quán)利要求1-3任一所述的敲除系統(tǒng)在ATCC13869/14067/13032中aceE敲除中的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求1-3任一所述的敲除系統(tǒng)在ATCC14067中aceE及ilvA連續(xù)敲除中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求8或9任一所述的應(yīng)用，其特征在于敲除流程為：

（1）將敲除用質(zhì)粒從E.coli?JM109中提取，電轉(zhuǎn)化C.glutamicum菌株，涂布于含有乙酸鉀和卡那霉素的固體恢復(fù)培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)約36小時(shí)；

（2）挑取平板上單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，選取驗(yàn)證正確的單菌落，進(jìn)行液體培養(yǎng)，制備感受態(tài)；

（3）將質(zhì)粒pDTW109從E.coli?JM109中提取，電轉(zhuǎn)化上一步中制備的感受態(tài)，涂布于含有乙酸鉀和氯霉素的固體恢復(fù)培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)約36小時(shí)；

（4）挑取平板上單菌落進(jìn)行質(zhì)粒驗(yàn)證，選取驗(yàn)證正確的單菌落；

（5）將上一步獲得的菌株接種于液體培養(yǎng)基，37°C過夜培養(yǎng)；

（6）將上一步中過夜培養(yǎng)物劃線于含乙酸鉀的LBG固體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)約24小時(shí)；

（7）挑取平板上單菌落分別進(jìn)行抗性驗(yàn)證和PCR驗(yàn)證獲得敲除成功的目的菌株。