[發明專利]利用原位合成微流體芯片檢測轉基因番茄的方法

有效

• 申請號: 201310215315.3
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103290128A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 馮俊麗;王鳳軍;梁彥君
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明涉及番茄中轉基因成分的檢測和鑒定方法，尤其涉及采用原位合成微流體芯片檢測番茄中已知外源基因的方法。

背景技術

番茄（Solanum?lycopersicum）是重要的茄科作物之一，其果實富含維生素、胡蘿卜素、番茄紅素，具有較高的營養價值和保健功效，是世界范圍內重要的果蔬產品。近十年全世界番茄的種植面積和產量分別增加了38%和42%，產業化趨勢明顯。自1994年美國Calgene公司培育的延熟保鮮轉基因番茄FLAVR?SAVR獲準進入市場后，各種抗病毒、抗蟲、抗除草劑、抗凍害、抗鹽堿等品系改良番茄品種相繼報道，并有一部分獲準商業化種植，轉基因番茄大量投放市場已經成為不可抗拒的潮流。然而，有專家經實驗指出轉基因食品能增加小鼠患腫瘤的幾率，因此關于轉基因產品的安全性引起了社會廣泛的爭議，并且其對環境、食物原有營養體系的破壞，也是人們關注的焦點。

針對該種情況，國際社會一方面不斷健全和完善轉基因成分的檢測體系，另一方面出臺了標簽制度，以確保消費者對轉基因食品的知情權和選擇權利。我國也十分重視轉基因食品的安全管理，頒發了《農業轉基因生物安全管理條例》，將轉基因食品安全上升到法律層面。然而，我國對食品中轉基因成分的檢測體系相對滯后，很有必要加強這方面的研究。

目前，轉基因番茄的檢測集中在核酸水平，主要有定性PCR、熒光定量PCR、多重PCR和核酸雜交檢測技術。傳統的轉基因檢測方法常常局限于單一基因，檢測范圍窄，效率低。在當前導入農產品中的外源基因種類越來越多的情況下，單一項目的檢測已不能滿足食品監管需要，迫切需要開發高通量的快速轉基因檢測技術。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種利用原位合成微流體芯片檢測轉基因番茄的方法。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種利用原位合成微流體芯片的構建和檢測方法，包括以下步驟：

1）、轉基因番茄外源基因檢測的芯片探針的設計；

2）、制備寡聚核苷酸芯片；

3）、待測番茄樣品中基因組DNA的提取；

4）、基因組特定片段或整個基因組熒光標記；

5）、芯片雜交；

6）、判定樣品是否為轉基因番茄品種。

作為本發明的利用原位合成微流體芯片檢測轉基因番茄的方法的改進，所述步驟1）為：設計合成了如表1所述的895條寡核苷酸探針。

作為本發明的利用原位合成微流體芯片檢測轉基因番茄的方法的進一步改進，步驟2）為：

制備寡聚核苷酸芯片：先在原位合成微流體芯片上，依次合成化學修飾過的957條寡核苷酸探針序列；然后對合成好的芯片在芯片掃描儀上進行熒光分析，以檢測芯片本身的熒光本底；再用質控cDNA或來自于質粒的DNA片段進行熒光標記后，與芯片進行雜交，分析芯片特異性、靈敏度和重復性，評估芯片質量。

作為本發明的利用原位合成微流體芯片檢測轉基因番茄的方法的進一步改進，步驟3）為待測番茄樣品中基因組DNA的提取：

取0.1-0.2g番茄樣品，液氮研磨，裝入1.5?ml?無菌的eppendorf管中；加入1ml?CTAB提取液，于65℃水浴60-90min；離心取上清，加入酚/氯仿/異戊醇（體積比為25：24：1，共計用量為上清體積的2/3），充分混勻，離心取上清；加入氯仿/異戊醇，離心取上清；加入NaAC溶液和無水乙醇沉淀；離心棄上清，體積濃度為70%的酒精洗滌沉淀；離心棄上清，真空干燥；加入50-100?μ1?TE溶液溶解DNA。

作為本發明的利用原位合成微流體芯片檢測轉基因番茄的方法的進一步改進，

步驟4）為基因組特定片段或整個基因組熒光標記，可選用以下3種方法中的任意一種：