[發(fā)明專利]利用原位合成微流體芯片檢測轉基因番茄的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310215315.3
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103290128A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設計）人: 馮俊麗;王鳳軍;梁彥君
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.利用原位合成微流體芯片檢測轉基因番茄的方法，其特征是包括以下步驟：

1）、轉基因番茄外源基因檢測的芯片探針的設計；

2）、制備寡聚核苷酸芯片；

3）、待測番茄樣品中基因組DNA的提取；

4）、基因組特定片段或整個基因組熒光標記；

5）、芯片雜交；

6）、判定樣品是否為轉基因番茄品種。

2.根據(jù)權利要求1所述的利用原位合成微流體芯片檢測轉基因番茄的方法，其特征是，所述步驟1）為：設計合成了如表1所述的895條寡核苷酸探針。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的利用原位合成微流體芯片檢測轉基因番茄的方法，其特征是，所述步驟2）為：

制備寡聚核苷酸芯片：先在原位合成微流體芯片上，依次合成化學修飾過的957條寡核苷酸探針序列；然后對合成好的芯片在芯片掃描儀上進行熒光分析，以檢測芯片本身的熒光本底；再用質(zhì)控cDNA或來自于質(zhì)粒的DNA片段進行熒光標記后，與芯片進行雜交，分析芯片特異性、靈敏度和重復性，評估芯片質(zhì)量。

4.根據(jù)權利要求3所述的利用原位合成微流體芯片檢測轉基因番茄的方法，其特征是，所述步驟3）為待測番茄樣品中基因組DNA的提取：

取0.1-0.2g番茄樣品，液氮研磨，裝入1.5?ml?無菌的eppendorf管中；加入1ml?CTAB提取液，于65℃水浴60-90min；離心取上清，加入酚/氯仿/異戊醇（體積比為25：24：1，共計用量為上清體積的2/3），充分混勻，離心取上清；加入氯仿/異戊醇，離心取上清；加入NaAC溶液和無水乙醇沉淀；離心棄上清，體積濃度為70%的酒精洗滌沉淀；離心棄上清，真空干燥；加入50-100?μ1?TE溶液溶解DNA。

5.根據(jù)權利要求4所述的利用原位合成微流體芯片檢測轉基因番茄的方法，其特征是，所述步驟4）為基因組特定片段或整個基因組熒光標記，可選用以下3種方法中的任意一種：

方法A、以待檢番茄樣品DNA為模板，設計并篩選出轉基因番茄中常用的啟動子、終止子、報告基因、以及番茄種屬內(nèi)參照基因的引物，進行PCR反應，并對其進行CY3熒光標記；PCR反應體系中以CY3標記的dCTP代替普通dCTP；具體引物信息：35s-F/R:?5＇-GCTCCTACAAATGCCATCA-3＇/5＇-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3＇;?nos-F/R:?5＇-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3＇/5＇-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3＇;?35s-EFE-F/R:?5＇-TGGGATCTAAGCACTTGCAATTGGA-3＇/5＇-GCACAAACAGACGGGACACGAAT-3＇;?nptII-F/R:5＇-GAAAAATACCGCTGCGTAAAAG-3＇/5＇-TCAGGGCTTTGTTCATCTTCAT-3＇;?acc-F/R:5＇-TTTTGCCTCGCTGATCCTGGC-3＇/5＇-GGTTTCGCCTTTCGGCTTCTGT-3＇;?cry1AC-F/R:5＇-TCATCCCTTACGTCAGTGGAG-3＇/5＇-CCATCATTGCGATAAAGGAAA-3＇;?lat52-F/R:5＇-ATGCAGGAACATCAGCACAGAGGC-3＇/5＇-TCTTTGCAGTCCTCCCTTGGGCTT-3＇;?mcpi-F/R:?5＇-TGGCACAAGATGCAACTCTGACGA-3＇/?5＇-ACAGGCCTGACAGAACGTACCA-3＇;?apx-F/R:?5＇-CTCTTGGAGCCCATTAGGGAGCA-3＇/?5＇-TTGGAAGTAAGCACTACTTAGTAGTCATCAC-3＇;?fru-F/R:?5＇-GGTAGTTCAGTACCTGTGTTGGACG-3＇/?5＇-TGACATCTAATCCTAAGGTAGGGCG-3＇;

方法B、在方法A所用正向引物的5’端插入接頭Head-F?(gccttgttctaccattacgc)，反向引物5’端插入接頭Head-R?(tcagccacctctttgtcctt)；以待檢番茄樣品DNA為模板，用帶接頭的引物組合進行第一輪多重PCR擴增，擴增體系共11個循環(huán)后；然后以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，以通用加頭序列Head-F/Head-R?為引物，進行第二輪多重PCR?反應；PCR反應體系中以CY3標記的dCTP代替普通dCTP；

方法C、將待檢番茄樣品DNA先用限制性內(nèi)切酶AccII(FnuDII)消化，酶切條件為37℃，60min；酶切完成后用Random?Primer?DNA?Labeling?Kit?Ver.2.0（TaKaRa）進行隨機引物標記反應；反應體系中以CY3標記的dCTP代替普通dCTP。