[發明專利]特利加壓素的制備方法

無效

• 申請號: 201310214366.4
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103254295A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 路兵;徐偉;張鴻雁
• 申請（專利權）人: 青島國大生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C07K7/16
• 分類號: C07K7/16;C07K1/16;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 北京康盛知識產權代理有限公司 11331
• 代理人: 張良

技術領域

本發明涉及多肽藥物的制備方法，具體地說，涉及特利加壓素的制備方法。

背景技術

特利加壓素的化學名稱為三甘氨酰賴氨酸加壓素，是一種新型的人工合成的長效血管加壓素制劑。它是一種前體藥物，本身無活性，在體內經氨基肽酶作用，脫去其N末端的3個甘氨酰殘基后，緩慢“釋放”出有活性的賴氨酸加壓素，因此特利加壓素相當于一個能以穩定速率釋放出賴氨酸加壓素的儲藏庫。特利加壓素的主要作用是收縮內臟血管平滑肌，減少內臟血流量（如減少腸系膜、脾、子宮等的血流），從而減少門靜脈血流、降低門靜脈壓，同時也可作用于食道和子宮等平滑肌。另一方面，在對肝腎綜合征的防治研究中發現特利加壓素還可降低血漿腎素濃度，從而減少血管緊張素II產生，減輕腎血管收縮，增加肝腎綜合征患者的腎血流量，顯著增加了患者的腎小球濾過率，改善了腎功能。與血管加壓素相比，它作用持久，不引起危險性并發癥，包括促纖維蛋白溶解以及心血管系統方面的嚴重并發癥。

目前特利加壓素的制備方法主要包括以下步驟：以Rink?Amide樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc-Gly-OH；然后加入切肽試劑進行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品，加入堿性物質，在pH為7.5～10.0的條件下通空氣氧化，獲得氧化型粗品，最后采用C18（或C8）柱進行分離純化，獲得目標產物。但是該方法耦聯采用的縮合劑為TBTU或者HBTU/HOBt，隨著肽鏈的增長，耦聯越來越困難。此外，特利加壓素的空間位阻大，脫除難度大，也影響了合成的收率。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是現有特利加壓素的制備方法耦聯氨基酸，隨著肽鏈的增長，耦聯越來越困難。

本發明的技術方案如下：

一種特利加壓素的制備方法，包括：用脫保護試劑將Rink?AmideAM樹脂脫保護，去除Fmoc保護基團；以脫保護后的Rink?AmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以1-羥基苯并三氮唑（1-Hydroxybenzotriazole，HOBt）/N,N-二異丙基碳二亞胺（N,N-diisopropylcarbodiimide，DIC）為縮合劑，依次耦聯氨基酸，得到特利加壓素肽樹脂；耦聯第2～12位氨基酸之前，用所述脫保護試劑依次脫去上一位耦聯產物的Fmoc保護基團；裂解所述特利加壓素肽樹脂，然后加入乙醚沉淀所述特利加壓素肽樹脂，得到還原型特利加壓素粗肽；將所述還原型特利加壓素粗肽環化得到氧化型特利加壓素粗肽；將所述氧化型特利加壓素粗肽純化、轉鹽、濃縮和凍干得到特利加壓素。

進一步，所述脫保護試劑的制備方法為：將哌啶溶于二氯甲烷（dichloromethane，DCM）/氮氮二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF）/N-甲基吡咯烷酮（N-methyl-2-pyrrolidone，NMP）溶液中，并加入曲拉通-100，制備得到所述脫保護試劑，其中，DCM/DMF/NMP的體積比=1:1:1，哌啶占所述脫保護試劑的體積百分比為20%，曲拉通-100占所述脫保護試劑的體積百分比為1%；所述脫保護的反應溫度為15℃。

進一步：所述Rink?AmideAM樹脂的替代度≤0.6mmol/g。

進一步：耦聯第1位氨基酸時，Rink?AmideAM樹脂：氨基酸：HOBt：DIC的摩爾比為1:3:3:3；耦聯第2至第6位氨基酸時，上一位耦聯產物：氨基酸：HOBt：DIC的摩爾比為1:3:3:3；耦聯第7至第12位氨基酸時，上一位耦聯產物：氨基酸：HOBt：DIC的摩爾比為1:3.3:3.3:3.3；耦聯第7～12位氨基酸時，所述脫保護試劑的每次體積用量比耦聯第1位氨基酸時增加20%。

進一步：所述耦聯的溫度為32℃，時間為2.5～3小時。

進一步：所述裂解的裂解液各成分的體積比為三氟乙酸（trifluoroacetic?acid，TFA）：1,2-乙二硫醇（1,2-ethanedithiol，EDT）：三異丙基硅烷（Triisopropylsilane，TIS）：H₂O=92.5:2.5:4:1，裂解時間為2h。

進一步：所述環化的氧化劑為雙氧水，pH值為7.1～7.2，時間為2小時。

進一步：所述純化的色譜柱為直徑5cm、填料為粒徑10um的十八烷基鍵合硅膠、孔徑的C18柱，流動相分別為TFA溶液和乙腈，流速為50ml/min，上樣量為3～5g，色譜儀的檢測波長為280nm。