[發(fā)明專利]太平洋鱈魚精子高效超低溫冷凍保存方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310214264.2
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103314949A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉清華;李軍;于道德;官曙光
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院海洋研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種太平洋鱈魚精子高效超低溫冷凍保存方法。

背景技術(shù)

太平洋鱈Gadus?macrocephalus又名大頭鱈，分布于太平洋北部沿岸海域，從北太平洋西南部的黃海，經(jīng)韓國至白令海峽和阿留申群島，沿太平洋東海岸的阿拉斯加、加拿大至美國的洛杉磯一帶沿海，太平洋鱈是典型的冷水性海水魚類。我國太平洋鱈主要產(chǎn)于黃海，最高年產(chǎn)量達(dá)26000噸，是我國北方乃至世界的重要海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一。魚類精液的超低溫保存在水產(chǎn)養(yǎng)殖、遺傳育種以及種質(zhì)資源保存中具有重要的意義。魚類精液的超低溫保存可以使種質(zhì)的長距離運(yùn)輸?shù)靡詫崿F(xiàn)，同時有利于魚類的雜交、選育、優(yōu)良形狀的獲得以及基因多樣性的保護(hù)。太平洋鱈魚精子冷凍保存方法國內(nèi)外至今未見報道，因此，建立太平洋鱈魚精子超低溫保存的可靠方法對海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展以及生物多樣性的保護(hù)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種太平洋鱈魚精子超低溫冷凍保存方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種太平洋鱈魚精子高效超低溫冷凍保存方法：將太平洋鱈魚精液與抗凍液以1:4-1:3的體積比例混合，混合后在0-4℃孵育平衡8-10分鐘；孵育后以分段方式降溫處理；處理后投入到液氮（-196℃），分裝保存；

進(jìn)一步的說，采集處于繁殖期的太平洋鱈魚雄魚，將生殖孔微微發(fā)紅的雄魚從養(yǎng)殖池中撈出，放置于海綿上，蒸餾水沖洗生殖孔3次，用潔凈的紙巾擦凈，拇指與食指輕輕沿著精巢的位置從后向前擠壓，用5ml的一次性吸管采集新鮮精液魚5ml的離心管中，避光存放于0-4℃的冰盒中，取活力高于80%精液，保存待用。

所述抗凍液由稀釋液、抗凍劑、添加劑組成，其中稀釋液為：NaCl?8g/L，Na₂HPO₄·2H₂O?0.6g/L，KH₂PO₄?0.6g/L，海藻糖37.8g/L；抗凍劑為終濃度10%（V/V）的丙二醇（PG）；添加劑為：終濃度5%（V/V）的蛋黃和終濃度5%BSA（V/V）。抗凍液的配制進(jìn)一步的說，首先用蒸餾水配置稀釋液，秤取NaCl8g，Na₂HPO4·2H₂O?0.06g，KH₂PO₄0.06g，海藻糖37.8g，然后定容至1L備用；采用已配置的稀釋液作為基礎(chǔ)液配置抗凍劑，其中含10%PG（V:V）（即100mL含10mLPG）；然后將已配置好的抗凍劑作為基礎(chǔ)液，加入5mL蛋黃和5mLBSA,定容至100mL。

所述抗凍液在使用前放置于0℃冰箱中預(yù)冷過夜，待用。所述經(jīng)抗凍液混合的大菱鲆的精液置于2ml或5ml的凍存管中。

所述采集處于繁殖期的太平洋鱈魚雄魚，將生殖孔微微發(fā)紅的雄魚從養(yǎng)殖池中撈出，放置于海綿上，蒸餾水沖洗生殖孔三次，用潔凈的紙巾擦凈，拇指與食指輕輕沿著精巢的位置從后向前擠壓，用5ml的一次性吸管采集新鮮精液魚5ml的離心管中，避光存放于0-4℃的冰盒中，取活力高于80%精液，保存待用。

所述太平洋鱈魚的精液與抗凍液在碎冰中（0℃）輕輕震蕩、充分混勻3-5min，然后以-5℃/min降溫至-60℃，然后再以-10℃/min降溫至-120℃平衡3min直接投入到液氮（-196℃）中保存。

將經(jīng)液氮冷凍保存的太平洋鱈魚凍精進(jìn)行解凍，將其直接放入35-40℃水浴90-120s，然后置于室溫18-20℃完全融解，而后于自然海水中激活。

通過計算機(jī)輔助分析系統(tǒng)檢測凍精活力，將載玻片上滴一滴自然海水，然后將載玻片置于顯微鏡下，用牙簽的尖部輕輕沾取凍精，在載玻片上的海水里混勻，顯微鏡目鏡調(diào)至20倍，觀察凍精的運(yùn)動狀態(tài)，將運(yùn)動速度高于20um/s的精子定義為運(yùn)動的精子，經(jīng)顯微測凍精的運(yùn)動率均高于85%；

解凍后的精子經(jīng)過超微結(jié)構(gòu)分析顯示70%以上的凍精的結(jié)構(gòu)與鮮精的結(jié)構(gòu)一致，均保持了結(jié)構(gòu)的完整性。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明冷凍保存方法中抗凍液采用丙二醇（PG）為抗凍劑，滲透性好而且毒性小；同時加入5%（V/V）蛋黃和5%BSA（V/V），對精子的質(zhì)膜起到很好的保護(hù)作用，而且稀釋液中的海藻糖對精子的在平衡處理及冷凍過程中的氧化損傷有預(yù)防和修復(fù)作用；