[發(fā)明專利]一種星斑川鰈精子超低溫冷凍保存方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310213169.0
• 申請(qǐng)日: 2013-05-31
• 公開（公告）號(hào): CN103314948A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉清華;李軍;徐世宏;韓龍江
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種星斑川鰈精子超低溫冷凍保存方法。

背景技術(shù)

星斑川鰈(Platichthys?stellatus)隸屬鰈形目(Pleuronectiformes)鰈科(Pleuronectidae)鰈亞科(Pleu-ronectinae)川鰈屬(Platichthys)，俗稱珍珠鰈、沼鰈等，英文名Starry?flounder(繁星鰈)。星斑川鰈分布于北太平洋的亞洲和美洲沿岸(30°～70°N)海域，主要有北冰洋、東西伯利亞海、白令海峽、鄂霍次克海、朝鮮海峽、日本海、北極的阿拉斯加海灣、波弗特海、楚科奇海、加冕海灣、拉普捷夫海、加利福尼亞海域。主要分布國(guó)有加拿大、美國(guó)、俄羅斯聯(lián)邦、中國(guó)、朝鮮、韓國(guó)和日本等。星斑川鰈目前已經(jīng)成為重要的養(yǎng)殖魚種，是具有極高商業(yè)開發(fā)價(jià)值的比目魚類。日本、前蘇聯(lián)、韓國(guó)、加拿大等國(guó)家對(duì)于星斑川鰈的研究較多；我國(guó)對(duì)星斑川鰈的研究?jī)H見對(duì)星斑川鰈的分類學(xué)進(jìn)行了少量報(bào)道。美國(guó)和日本對(duì)星斑川鰈早期發(fā)育作了詳細(xì)系統(tǒng)的描述。近年來，由于養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，加之對(duì)星斑川鰈種質(zhì)需求的不斷擴(kuò)大，星斑川鰈的精子冷凍技術(shù)急需建立起來。魚類精液的超低溫保存在水產(chǎn)養(yǎng)殖、遺傳育種以及種質(zhì)資源保存中具有重要的意義。魚類精液的超低溫保存可以使種質(zhì)的長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)靡詫?shí)現(xiàn)，同時(shí)有利于魚類的雜交、選育、優(yōu)良性狀的獲得以及基因多樣性的保護(hù)。因此，建立星斑川鰈精子大容量超低溫保存的可靠方法對(duì)海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展以及生物多樣性的保護(hù)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種星斑川鰈精子超低溫冷凍保存方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種星斑川鰈精子超低溫冷凍保存方法，將星斑川鰈的精液與抗凍液按體積比1:3的比例混合，在0℃孵育6-8分鐘，孵育后以分段方式降溫處理；處理后投入到液氮（-196℃），分裝保存；

所述抗凍液由稀釋液、抗凍劑和添加劑組成；其中，稀釋液為100mM蔗糖，100mM?KHCO₃，25mM?NaHCO₃；抗凍劑為終濃度8%的（V/V）DMSO（二甲基亞砜）和終濃度7%的（V/V）Gly（甘油）；添加劑：5mM還原型谷胱甘肽，50mM牛磺酸，10%蛋黃（V/V）。

所述抗凍液在使用前放置于0℃冰箱中預(yù)冷過夜，待用。所述凍存管為2ml或5ml的凍存管。

所述蛋黃由雞蛋分離蛋白并攪拌均勻所得。

將混合抗凍液和精液的凍存管置于碎冰中（0℃）輕輕震蕩混勻6min，使之充分混勻，然后置于0℃平衡2min；而后以分段降溫方式處理，即以-8℃/min的降溫速率降溫至-60℃，然后再以-15℃/min的降溫速率降溫至-120℃平衡2分鐘。

所述星斑川鰈的精液是采集處于繁殖期的星斑川鰈雄魚，將雄魚從養(yǎng)殖池中撈出，放置于海綿上，蒸餾水沖洗生殖孔、擦凈，輕輕擠壓腹部獲得新鮮精液，而后將活力高于85%的精液與抗凍液混合。

將經(jīng)液氮處理分裝保存的星斑川鰈凍精進(jìn)行解凍，將其直接放入37℃水浴100s，然后置于室溫至完全融化，而后于自然海水中激活。

所述凍精進(jìn)行解凍直接放入37℃水浴100s，期間不斷搖動(dòng)凍存管。

上述解凍后的凍精采用自然海水激活，載玻片上滴一滴自然海水，置于顯微鏡下，用牙簽的尖部輕輕沾取凍精，在載玻片上的海水里混勻，經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助分析解凍后精子活率高于70%。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明把星斑川鰈精子經(jīng)過抗凍劑處理、降溫冷凍、置于液氮中長(zhǎng)期保存的過程；其冷凍保存方式凍存管容積較大，保存精液量大；

2.本發(fā)明采用二甲亞砜（DMSO）與甘油（Gly）混合為抗凍劑，保持較好滲透性的同時(shí)又降低了毒性；

3.本發(fā)明的抗凍液中加入了還原型谷胱甘肽5mM；牛磺酸50mM；10%蛋黃（V/V），對(duì)精子的質(zhì)膜起到很好的保護(hù)作用；

4.本發(fā)明冷凍方式在降溫前，鮮精與抗凍液進(jìn)行了充分的震蕩混勻、孵育6-8min，使得鮮精在程序降溫冷凍前得到充分的脫水和保護(hù)；

5.本發(fā)明冷凍分段降溫時(shí)，采用以-8℃/min速度降溫，使冷凍精子安全度過“危險(xiǎn)溫度區(qū)”，然后采用-15℃/min的降溫速率快速進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)-120℃，然后投入液氮；

6.本發(fā)明冷凍精子從液氮中取出后，采用二步解凍法，37℃和20℃兩步解凍，可使精子快速度過重結(jié)晶區(qū)，同時(shí)又避免了局部溫度過高導(dǎo)致的損傷；