[發明專利]一種大菱鲆精子高效超低溫冷凍保存的方法

有效

• 申請號: 201310213012.8
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103348966A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 劉清華;李軍;肖志忠;韓龍江
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明屬海洋生物技術領域，具體地說是一種大菱鲆精子高效超低溫冷凍保存的方法。

背景技術

大菱鲆(Scophthalmus?maximus)隸屬于鲆科、菱鲆屬,英文名Turbot,又稱“多寶魚”,是一種歐洲沿海特有的比目魚,屬冷溫性魚類,主要分布于大西洋東北部沿岸,黑海、波羅的海和地中海也有分布。由于其生長速度快、肉質鮮美、病害較少且便于密養,是工廠化養殖的理想品種。我國于1992年首次從英國引進大菱鲆苗種,通過馴化、試養和人工繁殖,1999年突破生產性育苗技術,大菱鲆養殖業在我國得到蓬勃發展,目前已建立起一整套親魚調控、人工苗種培育及工廠化養殖生產技術。大菱鲆目前已經成為我國北方最重要的海水魚類養殖品種之一，具有極高商業價值。由于大菱鲆雄魚產精時間短，產精量少等特點，嚴重制約了其優質受精卵的獲得和苗種的產量。冷凍大菱鲆精子可以通過人工性腺發育調控一批成熟雄性大菱鲆親魚，集中批量保存優質大菱鲆精液，在需要時解凍進行人工授精獲得受精卵，從而克服了大菱鲆在繁育期優質精液供不應求的困難。近年來，由于養殖規模的不斷擴大，加之對大菱鲆種質需求的不斷擴大，大菱鲆的精子冷凍技術急需建立起來。建立大菱鲆精子大容量超低溫保存的可靠方法對促進海水養殖業的發展以及種質資源的保護都具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種大菱鲆精子高效超低溫冷凍保存的方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

一種大菱鲆精子高效超低溫冷凍保存的方法，將大菱鲆的精液與抗凍液按體積比3:1-4:1的比例混合，混合后經過兩步降溫處理，一步平衡后投入到液氮（-196℃），分裝保存；抗凍液由稀釋液、抗凍劑、添加劑三部分組成.

其中，稀釋液為NaCl8g/L，KCl0.4g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，MgCl₂·6H₂O0.1g/L，Na₂HPO₄·2H₂O0.06g/L，KH₂PO₄0.06g/L，NaHCO₃0.35g/L；抗凍劑為終濃度60%（V/V）的DMSO（二甲基亞砜）或終濃度60%（V/V），的丙二醇（PG）；添加劑：蔗糖34.2g/L和終濃度10%的蛋黃（V/V）。

進一步的說，抗凍液的配置過程：首先用蒸餾水配置稀釋液，秤取NaCl8g，KCl0.4g，MgSO₄·7H₂O0.1g，MgCl₂·6H₂O0.1g，Na₂HPO₄·2H₂O0.06g，KH₂PO₄0.06g，NaHCO₃0.35g，然后定容至1L備用；采用已配置的稀釋液作為基礎液配置抗凍液，其中含60%DMSO（V:V）（即100mL抗凍液含60mLDMSO）或60%PG（V:V）（即100mL抗凍液含60ml?PG)；然后將已配置好的抗凍液作為基礎液，加入蔗糖3.42g，蛋黃10ml,定容至100mL。

所述抗凍液在使用前放置于0℃冰箱中預冷過夜，待用。所述經抗凍液混合稀釋的大菱鲆的精液置于2ml或5ml的凍存管中。

所述大菱鲆的精液與抗凍液在碎冰中（0℃）輕輕震蕩、充分混勻30s-1min，然后以-8℃/min降溫至-80℃，然后以-10℃/min降溫至-120℃，平衡2分鐘后投入到液氮（-196℃），分裝保存。

將分裝保存于液氮中的大菱鲆凍精進行解凍，具體方法為：將存有精液的凍存管直接放入37-40℃水浴中解凍100-110s，然后置于室溫（18-20℃）條件下完全融化，自然海水中激活。

進一步的說，所述凍精直接放入37-40℃水浴中100-110s進行解凍，期間不斷搖動凍存管。

凍精激活具體為，載玻片滴入100μL海水，然后加入1-2μL凍精，吸打3-5次使其充分混勻，隨即取3個視野，檢測運動精子的數量占視野中所有精子的比例，經檢測解凍后精子的運動率與鮮精差異不顯著，80%以上做快速的直線運動。

本發明具有如下優點：

1.本發明冷凍保存過程中采用高濃度的DMSO或PG作抗凍劑，保持較好滲透性的同時又降低了毒性；