[發明專利]一種大菱鲆精子高效超低溫冷凍保存的方法有效
| 申請號： | 201310213012.8 | 申請日： | 2013-05-31 |
| 公開（公告）號： | CN103348966A | 公開（公告）日： | 2013-10-16 |
| 發明（設計）人： | 劉清華;李軍;肖志忠;韓龍江 | 申請（專利權）人： | 中國科學院海洋研究所 |
| 主分類號： | A01N1/02 | 分類號： | A01N1/02 |
| 代理公司： | 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002 | 代理人： | 周秀梅;李穎 |
| 地址： | 266071*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 大菱鲆 精子 高效 超低溫 冷凍 保存 方法 | ||
1.一種大菱鲆精子高效超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：
將大菱鲆的精液與抗凍液按體積比3:1-4:1的比例混合，混合后經過兩步降溫處理，一步平衡后投入到液氮（-196℃），分裝保存；
抗凍液由稀釋液、抗凍劑、添加劑三部分組成
其中，稀釋液為NaCl8g/L，KCl0.4g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，MgCl2·6H2O0.1g/L，Na2HPO4·2H2O0.06g/L，KH2PO40.06g/L，NaHCO30.35g/L；抗凍劑為終濃度60%（V/V）的DMSO（二甲基亞砜）或終濃度60%（V/V），的丙二醇（PG）；添加劑：蔗糖34.2g/L和終濃度10%的蛋黃（V/V）。
2.按權利要求1所述的大菱鲆精子高效超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：所述抗凍液在使用前放置于0℃冰箱中預冷過夜，待用。
3.按權利要求1所述的大菱鲆精子高效超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：所述經抗凍液混合稀釋的大菱鲆的精液置于2ml或5ml的凍存管中。
4.按權利要求1所述的大菱鲆精子高效超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：所述大菱鲆的精液與抗凍液在碎冰中（0℃）輕輕震蕩、充分混勻30s-1min，然后以-8℃/min降溫至-80℃，然后以-10℃/min降溫至-120℃，平衡2分鐘后投入到液氮（-196℃），分裝保存。
5.按權利要求1所述的大菱鲆精子高效超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：將分裝保存于液氮中的大菱鲆凍精進行解凍，具體方法為：將存有精液的凍存管直接放入37-40℃水浴中解凍100-110s，然后置于室溫（18-20℃）條件下完全融化，自然海水中激活。
6.按權利要求1所述的大菱鲆精子高效超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：所述凍精直接放入37-40℃水浴中100-110s進行解凍，期間不斷搖動凍存管。
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