[發明專利]位點突變的高活熱穩定性納豆激酶基因及其應用

有效

• 申請號: 201310211134.3
• 申請日: 2013-05-30
• 公開（公告）號: CN103255156A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 唐選明;李淑英;聶瑩
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農產品加工研究所
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/56;C12R1/125
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域：

本發明涉及一種新型納豆激酶編碼基因及多肽，特別是一種因位點突變引起的活性和熱穩定性均提高的納豆激酶基因。本發明還涉及此基因在制備納豆激酶方面的應用。

背景技術：

當前高活、廉價、安全的溶栓藥物發現是解決血栓疾病的關鍵。納豆激酶（nattokinase，NK）是迄今為止發現的最好的具有溶栓作用的生物酶之一，在溶解血栓方面具有高效、安全、價格低廉、無毒副作用等優點，一直備受食品、生物及醫藥界研究人士的關注和重視。

納豆激酶是由納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus?natto）分泌表達的堿性絲氨酸蛋白酶，具有高效的纖維蛋白溶解活性。

納豆激酶由aprN基因編碼，含有由29個亞基組成的信號肽，77個亞基組成的前導肽和275個亞基組成的成熟多肽，成熟肽分子量27.7KDa。NK活性中心包括催化三聯體（Asp32、His64和Ser221），氧離子洞（Asn155）和底物結合位點（Ser125、Leu126和Gly127）。

獲得高活、熱穩定性納豆激酶基因是研究溶栓納豆激酶類保健食品及藥品的關鍵；發現納豆激酶中的相關活性區域或者位點，對于研究該酶的相關分子機制，及定向改造出更好的納豆激酶類保健食品及新藥具有重要的意義。

發明內容：

本發明的目的是提供一種能夠提高納豆激酶活性和熱穩定性的基因以及蛋白。

本發明的第一方面，提供高活熱穩定性納豆激酶多肽，它包含：具有SEQ?ID?NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組：(a)具有SEQ?ID?NO:2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ?ID?NO:2氨基酸序列不穩定區169-178、203-216、223-230、234-243、260-274和345-363經過一個或多個氨基酸殘基的替換而形成的，且具有更高納豆激酶活性和/或熱穩定性的由(a)衍生的多肽。

本發明的第二方面，提供編碼這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組：(a)編碼上述納豆激酶的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。

本發明人經過廣泛而深入的研究，首先通過分子克隆方法從高活熱穩定性納豆激酶生產菌Bacillus?subitilis?BSNK-T160（CGMCC?No.6714）獲得納豆激酶全基因（SEQ?ID?NO:1所示序列，編碼的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2），構建該基因的大腸桿菌重組表達體系，重組酶活性和熱穩定性分析證實位于不穩定區段169-178和223-230的175和225位氨基酸殘基替換導致納豆激酶活性和熱穩定性提高。在此基礎上完成了本發明。

本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。

本發明還提供納豆激酶的類似物，這些類似物與納豆激酶的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然的、突變的或者合成的遺傳變異體。

本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。編碼多肽的編碼區序列可以與SEQ?ID?NO:1所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發明中是指編碼具有SEQ?ID?NO:2的蛋白質，但與SEQ?ID?NO:1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。

本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括單點或多點取代變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。

本發明的納豆激酶核苷酸全長序列通常可以用PCR擴增法、人工合成、或重組法的方法獲得。

一旦獲得了有關的序列，就可用重組法大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。

通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多聚核苷酸序列來表達或生產重組的納豆激酶多肽。一般來說有以下步驟：