[發(fā)明專利]一種檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310210065.4
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103255196A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發(fā)明（設計）人: 鄢丹;張樂樂;馬麗娜;章從恩;熊呤;肖小河
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京東正專利代理事務所(普通合伙) 11312
• 代理人: 劉瑜冬

1.一種檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟，（1）分別制備不同濃度的腫瘤細胞懸液、黃連生物堿單體藥液；（2）利用實時細胞分析儀對不同細胞濃度腫瘤細胞懸液中的細胞生長指數(shù)進行監(jiān)測，確定檢測黃連生物堿單體藥液對腫瘤細胞作用時，所使用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度及添加藥液的最佳給藥時間點；（3）利用實時細胞分析儀檢測給藥前后的腫瘤細胞生長指數(shù)值，根據(jù)細胞生長指數(shù)值判斷藥液對腫瘤細胞的作用。

2.根據(jù)權利要求1所述的檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法，其特征在于，所述步驟（2）的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入100μl的腫瘤細胞培養(yǎng)液，再將檢測板置入培養(yǎng)箱中的細胞分析儀上，培養(yǎng)箱中CO₂的體積濃度為5%，溫度為37℃；②設置信號采集頻率為1次/min,測量實時細胞分析儀未有腫瘤細胞時培養(yǎng)液的細胞生長指數(shù)，將此時的細胞生長指數(shù)定位基準；③分別將100μl不同細胞濃度的腫瘤細胞懸液加入每個檢測板板孔中的腫瘤細胞培養(yǎng)液中，設定信號采集頻率為1次/5min,測量實時細胞分析儀有腫瘤細胞時培養(yǎng)液中的細胞生長指數(shù)；④分析比較不同濃度腫瘤懸液的細胞生長指數(shù)曲線，選擇腫瘤細胞加入到腫瘤細胞培養(yǎng)液后最快經(jīng)過潛伏期進入對數(shù)生長期，且當實時細胞分析儀檢測時間到100h時腫瘤細胞仍能處于對數(shù)生長期所對應的腫瘤細胞懸液細胞濃度，即為用于確定檢測黃連生物堿單體藥液對腫瘤細胞作用時，所使用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度；⑤分析④步確定的最佳細胞濃度的腫瘤懸液所對應的細胞生長指數(shù)曲線，當細胞生長指數(shù)為1的時間點，即為添加黃連生物堿單體藥液的最佳給藥時間點。

3.根據(jù)權利要求2所述的檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法，其特征在于，步驟④分析比較不同濃度腫瘤懸液的細胞生長指數(shù)曲線時，不同濃度腫瘤細胞懸液的腫瘤細胞濃度為2×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、8×10⁴的細胞懸液的細胞生長指數(shù)做分析比較，上述腫瘤細胞濃度的單位為個/ml。

4.根據(jù)權利要求2或3所述的檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法，其特征在于，步驟④確定的用于檢測黃連生物堿單體藥液對腫瘤細胞作用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度為4×10⁴個/ml。

5.根據(jù)權利要求1所述的檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法，其特征在于，所述步驟（3）的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入100μl的腫瘤細胞培養(yǎng)液，再將檢測板置入培養(yǎng)箱中的細胞分析儀上，培養(yǎng)箱中CO₂的體積濃度為5%，溫度為37℃，設置信號采集頻率為1次/min,實時細胞分析儀檢測未有腫瘤細胞時培養(yǎng)液的細胞生長指數(shù)，將此時的細胞生長指數(shù)定位基準；②將步驟（2）確定的最佳細胞濃度的腫瘤細胞懸液100μl加入到每個檢測板板孔的腫瘤細胞培養(yǎng)液中，設定信號采集頻率為1次/15min，實時細胞分析儀對培養(yǎng)液中腫瘤細胞的細胞生長指數(shù)進行監(jiān)測；③待細胞生長到步驟（2）確定的最佳給藥時間點時，吸棄檢測板板孔中的腫瘤細胞培養(yǎng)液，再向每個板孔中加入200μl不同濃度的黃連生物堿單體藥液，另設置2個板孔，添加200μl腫瘤細胞培養(yǎng)液，即為空白對照板孔；④設定信號采集頻率為1次/min，細胞實時分析儀監(jiān)測黃連生物堿單體藥液中腫瘤細胞生長指數(shù)。

6.根據(jù)權利要求1、2、5中任意一項所述的檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法，其特征在于，所述黃連生物堿單體藥液的配制方法是，黃連生物堿單體用腫瘤細胞培養(yǎng)液超聲溶解10～20min，再用孔徑為0.2μm的微孔濾膜過濾除菌得到母液，用腫瘤細胞培養(yǎng)液將母液稀釋，得到不同濃度的黃連生物堿單體藥液。

7.根據(jù)權利要求1、2、5中任意一項所述的檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法，其特征在于，所述的實時細胞分析儀為DP型實時細胞分析儀。

8.根據(jù)權利要求1所述的檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法，其特征在于，所述腫瘤細胞為肝癌HepG2細胞。

9.根據(jù)權利要求1所述的檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法，其特征在于，所述腫瘤細胞培養(yǎng)液為質量濃度10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液或質量濃度10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液。

10.根據(jù)權利要求6所述的檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法，其特征在于，所述黃連生物堿單體為小檗堿、巴馬汀或非洲防己堿、黃連堿、藥根堿或表小檗堿。