[發明專利]一種檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法

有效

• 申請號: 201310210065.4
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103255196A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 鄢丹;張樂樂;馬麗娜;章從恩;熊呤;肖小河
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三〇二醫院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京東正專利代理事務所(普通合伙) 11312
• 代理人: 劉瑜冬

技術領域

本發明屬于生物中檢測細胞活性方法的技術領域，具體是一種檢測黃連生物堿單體對腫瘤細胞作用的方法。

背景技術

黃連（Coptis?Chinensis?Franch）是一味常用中藥，黃連中主要含有的生物堿有小檗堿、黃連堿、藥根堿、巴馬汀等。近年來研究表明，小檗堿、黃連堿等具有一定的抗腫瘤作用，可抑制和殺傷多種癌細胞，如肝癌HepG2細胞、肺癌GLC-82細胞、胃癌MGC-803細胞等。尋找具有抗腫瘤活性的中藥單體受到越來越多的關注，評價各種中藥單體是否具有滅殺腫瘤細胞的作用，則要依靠對其抗腫瘤活性的檢測來判斷。目前，這種在體外檢測中藥單體抗腫瘤實驗以傳統的斷點檢測方法為主，如MTT法、熒光染色法、3H-Tdr（3H-Thymidine，三氫胸腺嘧啶核苷）摻入法等。這些方法以給藥前后細胞增殖和存活能力變化作為評價指標，需要進行特定的標記和處理，操作繁瑣，靈敏性較差且只能局限于特定時間點觀察，無法得到藥物作用的直觀動態過程。

發明內容

為解決上述技術缺陷，本發明公開了一種檢測黃連生物堿單體抗腫瘤活性的方法，該方法可實時反映給藥前后的腫瘤細胞經歷的生長、伸展、形態變化、死亡生理狀態，具有高度的靈敏性和可重復性，無需標記，檢測結果穩定、精確。

實現上述目的技術方案是，本發明設計的檢測黃連生物堿單體對腫瘤作用的方法，包括以下步驟，（1）分別制備不同濃度的腫瘤細胞懸液、黃連生物堿單體藥液；（2）利用實時細胞分析儀對不同細胞濃度腫瘤細胞懸液中的細胞生長指數進行監測，確定檢測黃連生物堿單體藥液對腫瘤細胞作用時，所使用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度及添加藥液的最佳給藥時間點；（3）利用實時細胞分析儀檢測給藥前后的腫瘤細胞生長指數值，根據細胞生長指數值判斷藥液對腫瘤細胞的作用。

所述步驟（2）的具體操作步驟是，①在實時細胞分析儀的檢測板每個板孔中分別加入100μl的腫瘤細胞培養液，再將檢測板置入培養箱中的細胞分析儀上，培養箱中CO₂的體積濃度為5%，溫度為37℃；②設置信號采集頻率為1次/min,測量實時細胞分析儀未有腫瘤細胞時培養液的細胞生長指數，將此時的細胞生長指數定位基準；③分別將100μl不同細胞濃度的腫瘤細胞懸液加入每個檢測板板孔中的腫瘤細胞培養液中，設定信號采集頻率為1次/5min,測量實時細胞分析儀有腫瘤細胞時培養液中的細胞生長指數；④分析比較不同濃度腫瘤懸液的細胞生長指數曲線，選擇腫瘤細胞加入到腫瘤細胞培養液后最快經過潛伏期進入對數生長期，且當實時細胞分析儀檢測時間到100h時腫瘤細胞仍能處于對數生長期所對應的腫瘤細胞懸液細胞濃度，即為用于確定檢測黃連生物堿單體藥液對腫瘤細胞作用時，所使用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度；⑤分析④步確定的最佳細胞濃度的腫瘤懸液所對應的細胞生長指數曲線，當細胞生長指數為1的時間點，即為添加黃連生物堿單體藥液的最佳給藥時間點。

步驟④分析比較不同濃度腫瘤懸液的細胞生長指數曲線時，不同濃度腫瘤懸液的腫瘤細胞濃度為2×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、8×10⁴的細胞懸液的細胞生長指數做分析比較，上述腫瘤細胞濃度的單位為個/ml。

步驟④確定的用于檢測黃連生物堿單體藥液對腫瘤細胞作用的腫瘤細胞懸液的最佳細胞濃度為4×10⁴個/ml。

確定用于實時細胞分析儀檢測時的細胞懸液濃度依據是細胞添加到培養液中能較快經過潛伏期進入對數生長期，且實時細胞分析儀檢測結束時細胞仍處于對數生長期。依據腫瘤細胞的對數生長期作為判斷細胞懸浮液濃度指標的原因是，對數生長期是細胞活力最好時期，是進行實驗的最佳時期，細胞濃度過小則細胞需要經過較長時間的潛伏期才能進入對數生長期，導致試驗周期過長；細胞濃度過大則營養物質消耗快，且細胞易粘連、疊加，則細胞很快經過對數生長期并開始脫落、死亡。在選擇用于檢測的最佳細胞濃度時，一般選擇腫瘤細胞進入對數生長期的?1/3～2/3細胞的生長率顯著增高的時段，同時為了方便后續不同濃度黃連生物堿單體藥液添加到腫瘤細胞懸液中的細胞生長曲線好擬合對比，綜合考察，一般細胞指數為1的時間點，為最佳的給藥時間。