[發(fā)明專利]一種皮卡那肽的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310209459.8
• 申請(qǐng)日: 2013-05-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104211777A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宓鵬程;潘俊鋒;馬亞平;袁建成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 北京北翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多肽的制備方法，具體地涉及皮卡那肽的制備方法。

背景技術(shù)

皮卡那肽（Plecanatide）是一種合成的尿鳥(niǎo)苷素類似物（尿鳥(niǎo)苷素是一種促尿鈉排泄激素，能夠調(diào)節(jié)胃腸道中離子和液體的轉(zhuǎn)運(yùn)），皮卡那肽進(jìn)入體內(nèi)后與胃腸道黏膜內(nèi)皮細(xì)胞上的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶C結(jié)合并將其激活，活化囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)，促進(jìn)氯化物和水分進(jìn)入腸道，從而促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，改善便秘癥狀。

Synergy公司于2010年l0月6日公布其在研新藥皮卡那肽(代碼：SP304)治療胃腸道疾病的II?a期臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這項(xiàng)在慢性便秘患者中進(jìn)行的研究顯示，該藥物能夠改善患者的腸道功能，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，減少腹部不適狀。在試驗(yàn)中，沒(méi)有出現(xiàn)腹瀉等不良反應(yīng)，在試驗(yàn)劑量下也沒(méi)有檢測(cè)到皮卡那肽被系統(tǒng)吸收。該藥物有望用于治慢性便秘(CC)、便秘型腸道易激綜合征(IBS-C)以及其他胃腸道疾病。CC和IBS-C都是常見(jiàn)的胃腸道疾病，可能對(duì)患者的工作和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。Synergy公司將繼續(xù)進(jìn)行皮卡那肽的其他臨床試驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明采用固液結(jié)合的方法合成皮卡那肽，具有操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化率高、溶劑使用量少、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)兩對(duì)二硫鍵采用定向方法合成，避免了二硫鍵錯(cuò)配情況的發(fā)生，有利于后續(xù)純化。

皮卡那肽的結(jié)構(gòu)為：

H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-C?ys-Leu-OH(二硫鍵4-12,7-15)

本發(fā)明提供了一種制備皮卡那肽的方法，包括以下步驟：

1）將Fmoc-Leu-OH與樹(shù)脂偶聯(lián)，得到Fmoc-Leu-樹(shù)脂；

2）按照皮卡那肽的肽序從C端到N端依次將氨基酸原料偶聯(lián)到步驟1）得到的Fmoc-Leu-樹(shù)脂上，得到肽樹(shù)脂片段H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(X)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Y)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(X)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Y)-Leu-樹(shù)脂，其中X和Y選自Trt、Acm、mmt或StBu，并且X不同于Y；

3）將步驟2）得到的肽樹(shù)脂裂解并脫除除Cys外的氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，并分別脫除Cys的兩種保護(hù)基X和Y，經(jīng)氧化分別形成兩對(duì)二硫鍵，得到皮卡那肽。

其中，步驟1）所述的樹(shù)脂是Wang樹(shù)脂或CTC樹(shù)脂，所用的偶聯(lián)劑為：a)所用樹(shù)脂為wang樹(shù)脂時(shí)所用偶聯(lián)劑為HOBT/DIC/DMAP；b)所用樹(shù)脂為2-CTC樹(shù)脂時(shí)所用偶聯(lián)劑為DIPEA。

步驟1）所述的Fmoc-Leu-樹(shù)脂的替代度為0.25～0.55mmol/g。

步驟2）中所用的偶聯(lián)劑為HOBT/DIC。

步驟3）中，根據(jù)反應(yīng)條件不同，脫除Cys的保護(hù)基X或Y可以與裂解肽樹(shù)脂并脫除除Cys外的其他氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基同時(shí)進(jìn)行；脫除Cys的保護(hù)基X或Y也可與氧化形成二硫鍵（4-12）或二硫鍵（7-15）同時(shí)進(jìn)行；但是二硫鍵（4-12）和二硫鍵（7-15）的形成是分別進(jìn)行的，這樣可避免二硫鍵錯(cuò)配（例如（4-7）、（12-15））情況的發(fā)生，有利于后續(xù)純化。

其中可使用含5%TFA的裂解液，優(yōu)選TFA：DCM=5：95（V/V）將肽片段從CTC樹(shù)脂上裂解下來(lái)或?qū)?cè)鏈保護(hù)基mmt脫除。

可使用含95%TFA的裂解液，優(yōu)選TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）將肽片段從CTC樹(shù)脂或wang樹(shù)脂上裂解下來(lái)，或?qū)?cè)鏈保護(hù)基Trt、OtBu、tBu或mmt脫除。

可使用I₂溶液，優(yōu)選含300mmol/l?I₂的乙醇溶液將側(cè)鏈保護(hù)基Acm脫除。

可使用β-巰基乙醇溶液，優(yōu)選含20%β-巰基乙醇和0.1M?N-甲基嗎啉的DMF或水溶液將側(cè)鏈保護(hù)基StBu脫除。

步驟3）中形成二硫鍵的條件為各種可使脫去側(cè)鏈保護(hù)基的Cys之間形成二硫鍵的氧化條件，包括但不限于空氣或氧氣氧化、DMSO氧化、I₂氧化或H₂O₂氧化。

具體實(shí)施方式

本文的術(shù)語(yǔ)“肽樹(shù)脂”是指多肽的C端連有樹(shù)脂、N端的氨基連有Fmoc保護(hù)基的多肽樹(shù)脂。