[發明專利]一種豬血清中豬傳染性胃腸炎病毒或豬呼吸道冠狀病毒抗體的抗原及其ELISA檢測方法

無效

• 申請號: 201310209236.1
• 申請日: 2013-05-30
• 公開（公告）號: CN103275194A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 于天飛;黎明;范震宇;邵淑麗
• 申請（專利權）人: 齊齊哈爾大學
• 主分類號: C07K14/17
• 分類號: C07K14/17;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 高會會

技術領域

本發明涉及一種生物技術領域的檢測方法及抗原，具體是一種可區別檢測豬傳染性胃腸炎病毒或豬呼吸道冠狀病毒感染的間接ELISA檢測方法及抗原。

背景技術

豬傳染性胃腸炎（Transmissible?gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible?gastroenteritis?virus?of?swine，TGEV）引起的豬的一種急性，高度接觸性傳染病，各種年齡及品種的豬對本病均易感，其中2周齡以下仔豬的死亡率可達100%。目前，我國該病的發病率較高，對養豬業的影響較大。spike蛋白形成病毒粒子表面的突起，是3種主要結構蛋白之一。研究表明，spike蛋白攜帶TGEV主要的B淋巴細胞抗原決定簇，是唯一能誘導產生中和抗體和提供免疫保護作用的結構蛋白。spike蛋白含有4個抗原位點，從氨基末端開始依次定為C、B、D和A。研究表明，位點A和位點B為構象抗原表位，位點C和位點D為線性抗原表位。豬呼吸道冠狀病毒（Porcine?respiratory?coronavirus，PRCV）被認為是TGEV的基因缺失變異株，流行于歐盟和北美地區。與TGEV基因核酸序列相比，PRCV的基因組主要是在spike基因5′端有一個大的缺失區。缺失區大小因分離株的不同從621-681bp不等，進而喪失了B、C抗原位點。PRCV只能引起輕微的臨床癥狀。TGEV和PRCV能誘導機體產生完全交叉反應的中和抗體。我國幾乎每年都要從歐盟和北美地區進口種豬，TGE的檢疫是這些豬入境檢疫的一個重要組成部分，然而PRCV已經廣泛流行于歐美國家，因此有些雙邊條款明確規定TGEV抗體陽性不影響種豬的進口。但這些國家豬群中TGEV和PRCV共存的現狀潛伏著在進口種豬時TGEV強毒株傳入國內的危險。我國學者在應用進口診斷試盒檢測國內部分豬場豬血清的TGEV抗體和PRCV抗體時發現一部分血清樣品為PRCV陽性，表明我國豬群也存在PRCV感染。

TGEV血清抗體可通過多種不同的血清學方法檢測，如間接熒光抗體試驗（IFAT）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、放射免疫沉淀試驗（RIP）、血清中和試驗（SN）等，最常用的是SN試驗。IFAT的敏感性和可靠性不如SN試驗，而且需要特殊而昂貴的設備，不適合基層使用。TGEV與PRCV有一定相關性，使SN特異性不強，可能出現假陽性。隨著分子生物學的發展，重組抗原應用于TGEV血清學診斷的方法已有報道。針對N蛋白的ELISA診斷方法報道較多，但在理論上不能區分PRCV。目前，已有的商業化試劑盒，如SVANOVIRTM傳染性胃腸炎病毒/豬呼吸道冠狀病毒鑒別診斷試劑盒是基于阻斷ELISA而設計的，與常規間接ELISA相比，步驟更為繁瑣，所耗時間更多。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有的可區別豬傳染性胃腸炎病毒或豬呼吸道冠狀病毒抗體ELISA檢測方法步驟繁瑣、所耗時間較多的問題，而提供一種較為簡便的豬血清中豬傳染性胃腸炎病毒或豬呼吸道冠狀病毒抗體的抗原及其ELISA檢測方法。

本發明的一種豬血清中豬傳染性胃腸炎病毒或豬呼吸道冠狀病毒抗體的抗原，含有spike蛋白C抗原位點、spike蛋白D抗原位點和柔性氨基酸序列；所述的spike蛋白C抗原位點與spike蛋白D抗原位點通過柔性氨基酸序列連接，所述的spike蛋白C抗原位點的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；spike蛋白D抗原位點的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；柔性氨基酸的序列如SEQ?ID?NO：3所示。

所述抗原，在豬血清中豬傳染性胃腸炎病毒或豬呼吸道冠狀病毒抗體的間接ELISA檢測方法中使用。

本發明的一種豬血清中豬傳染性胃腸炎病毒或豬呼吸道冠狀病毒抗體的抗原及其ELISA檢測方法，包括如下步驟：

將豬血清中的氨基酸序列spike蛋白C抗原位點和D抗原位點，采用柔性氨基酸連接，得重組蛋白質；以重組蛋白質為抗原，采用間接ELISA方法檢測豬血清，確定豬血清中是否含有豬傳染性胃腸炎病毒或豬呼吸道冠狀病毒抗體。

本發明包含以下有益效果：

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本發明將含有豬傳染性胃腸炎胃腸炎病毒spike蛋白C、D兩個抗原位點的重組蛋白包被，通過1次常規間接ELISA方法區別檢測豬傳染性胃腸炎病毒或豬呼吸道冠狀病毒感染；實驗證明，本方法重復性好、靈敏度高、特異性強。

附圖說明