[發明專利]一種精確區分細胞周期的方法

在審

• 申請號: 201310208041.5
• 申請日: 2013-05-29
• 公開（公告）號: CN104215561A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 邱琳;陳峰
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種精確區分細胞周期的分析方法。

背景技術

細胞周期是指以有絲分裂方式增殖的細胞從親代分裂結束到子細胞分裂結束所經歷的過程，在這個過程中，細胞遺傳物質復制并加倍，且在分裂結束時平均分配到兩個子細胞中去。通常細胞周期由G0期、G1期、S期、G2期和M期組成，如圖1。細胞在G0期處于阻留靜止的狀態；G1期：細胞開始RNA和蛋白質的合成，但DNA含量仍保持二倍體；S期：DNA開始合成，這時細胞核內DNA的含量介于G1期和G2期之間，當DNA復制結束成為4倍體時，細胞進入G2期。G2期的細胞繼續合成RNA及蛋白質，直到進入有絲分裂期(M期)，細胞內遺傳物質平均分配到兩個子細胞中，并使細胞一分為二。這兩個子細胞或者重新開始下一個細胞周期，或者進入靜止期(G0期)。細胞周期是調控細胞正常生長、分裂的重要事件。細胞周期的研究有助于揭示抗腫瘤制劑的作用機制。在腫瘤細胞增殖中，細胞周期的調控失效，使細胞無限分裂；反之，若細胞周期調控正常則可迫使細胞從活躍的生長分裂期進入靜止的G0期。使用流式細胞儀分析細胞周期的變化已非常普遍。流式細胞儀(Flow?Cytometer)是通過光源照射高速流動狀態下的細胞，檢測其標記熒光染料后受激發射熒光的強度，從而獲得細胞大小、內部結構、組成特性等物理和生物學特征，具有檢測速度快、分析參數多、獲取信息量大、靈敏度高、準確性好、方法靈活等優點。傳統流式細胞儀檢測細胞周期的方法是對細胞內的脫氧核糖核酸(DNA)進行分析、用核酸染料標記DNA，通過流式細胞儀所檢測到的DNA含量直方圖可將細胞周期分為G0/G1期、S期、G2/M期三個細胞群體。該方法基于細胞周期DNA含量變化，因為G0、G1期DNA含量相同為二倍體、G2、M期DNA含量相同為四倍體，只能粗略地把細胞周期合并為G0/G1、S、G2/M三個細胞群體，計算其比例，如圖2。

綜上，本領域目前缺乏能將細胞周期區分得更為準確詳細，實現G0期與G1期分開，G2和M期分開的技術。

發明內容

本發明的目的在于提供一種精確區分細胞周期的方法。

在本發明的第一方面，提供一種精確測定細胞周期的方法，所述方法包括：

(1)以DNA染料、RNA染料、熒光標記的有絲分裂磷蛋白(MPM-2)抗體(較佳地為單克隆抗體)對細胞進行染色，所述的DNA染料、RNA染料和熒光標記具有不同的發射波長；DNA染料熒光用于區分細胞核染色體的倍型，RNA染料熒光用于區分細胞中RNA的量，MPM-2的熒光標記用于區分細胞是否處于分裂期；

(2)用具有三通道或三通道以上的流式細胞儀對染色后樣品進行檢測分析根據細胞中DNA染料、RNA染料、熒光標記的發射波長，在流式細胞儀激光束的激發下產生不同的熒光，熒光可被光學系統收集后轉化為電信號進而輸送到計算機進行運算分析，根據流式細胞結果圖，將細胞分為5個群體，分別為G0期、G1期、S期、G2期和M期；

較佳地，5個細胞群體中，細胞DNA量、RNA和量MPM-2表達量差異在于：若DNA含量為二倍體(2N)且RNA表達量低于整體細胞RNA量，即圈定Hochest33342標記的二倍體細胞群中PyroninY熒光強度低于整體細胞平均熒光強度(mean?fluorescence?intensity,MFI)的群體，為G0期細胞群；若DNA含量為二倍體(2N)且RNA表達量開始升高，即圈定Hochest33342標記的二倍體細胞群中PyroninY熒光強度等于整體細胞的平均熒光強度的群體，為G1期細胞群；若DNA含量為四倍體(4N)且MPM-2不表達，即圈定Hochest33342標記的四倍體細胞群中MPM-2熒光陰性的群體，為G2期細胞群；若DNA含量為四倍體(4N)且MPM-2開始表達，即圈定Hochest33342標記的四倍體細胞群中MPM-2熒光陽性的群體，為M期細胞群；若DNA含量介于二倍體與四倍體之間，圈定Hochest33342標記的二倍體與四倍體之間細胞群為S期細胞群。

在一個優選例中，所述的DNA染料是：Hochest33342；和/或

所述的RNA染料是：Pyronin?Y；和/或

所述的有絲分裂磷蛋白抗體的熒光標記包括：Cy5、Cy3、FITC、羅丹明、PE、PerCP、APC、PE-Cy7。

在另一優選例中，所述的方法中，用多聚甲醛(較佳地，終濃度為0.5%(w/v))的磷酸鹽溶液對細胞進行固定。