[發(fā)明專利]一種精確區(qū)分細(xì)胞周期的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310208041.5
• 申請日: 2013-05-29
• 公開（公告）號: CN104215561A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邱琳;陳峰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種利用流式細(xì)胞儀精確測定細(xì)胞周期的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：

(1)以DNA染料、RNA染料、熒光標(biāo)記的有絲分裂磷蛋白抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色，所述的DNA染料、RNA染料和熒光標(biāo)記具有不同的發(fā)射波長；

(2)用具有三通道或三通道以上的流式細(xì)胞儀對染色后樣品進(jìn)行檢測分析；根據(jù)流式細(xì)胞結(jié)果圖將細(xì)胞分為5個(gè)群體，分別為G0期、G1期、S期、G2期和M期。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNA染料是：Hochest33342；和/或

所述的RNA染料是：Pyronin?Y；和/或

所述的有絲分裂磷蛋白抗體的熒光標(biāo)記包括：Cy5、Cy3、FITC、羅丹明、PE、PerCP、APC、PE-Cy7。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括步驟：用多聚甲醛的磷酸鹽溶液對細(xì)胞進(jìn)行固定。

4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，DNA染料熒光通道采集數(shù)據(jù)設(shè)定為線性模式，RNA染料熒光通道采集數(shù)據(jù)設(shè)定為線性模式，有絲分裂磷蛋白抗體熒光標(biāo)記通道采集數(shù)據(jù)設(shè)定為對數(shù)模式。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，細(xì)胞獲取速度保持低速，優(yōu)選的≤500events/s，更佳的200-500events/s。

6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的Hochest33342的激發(fā)光波長為355nm，發(fā)射光波長為460nm；或

所述的Pyronin?Y的激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為560nm；

所述的有絲分裂磷蛋白熒光標(biāo)記是Cy5，其激發(fā)光波長為633nm，發(fā)射光波長為668nm。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法的步驟為：

(1)將細(xì)胞進(jìn)行固定；

(2)洗滌細(xì)胞并重懸，形成單個(gè)細(xì)胞懸液；

(3)離心，向細(xì)胞沉淀中加入冷的無水甲醇混勻，低溫過夜；

(4)按照步驟(2)所述方法用染色洗滌液洗滌；

(5)用熒光標(biāo)記的有絲分裂磷蛋白抗體對細(xì)胞染色；

(6)按照步驟(2)所述方法用染色緩沖液洗滌；

(7)重懸細(xì)胞，以Hochest33342和Pyronin?Y染色；

(8)流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算細(xì)胞分別處于每個(gè)期的比例；其中Hochest33342激發(fā)發(fā)射采用355/460nm，Pyronin?Y激發(fā)發(fā)射488/560nm，有絲分裂磷蛋白抗體的激發(fā)發(fā)射通道根據(jù)熒光標(biāo)記種類來選擇，其激發(fā)發(fā)射波長不同于Hochest33342和Pyronin?Y。

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法的步驟為：

(1)固定：取約1×10⁷個(gè)的細(xì)胞，加入新鮮配制的固定液，終濃度為0.5%(w/v)，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育10分鐘；

(2)洗滌：把步驟(1)所得的細(xì)胞用離心機(jī)在400g轉(zhuǎn)速5分鐘的條件下，離心洗滌去上清，用冷的磷酸鹽緩沖液1ml重懸細(xì)胞，劇烈混勻成單個(gè)細(xì)胞；

(3)通透：將步驟(2)中的所得細(xì)胞重懸液400g離心去上清，向細(xì)胞沉淀中加入冷的無水甲醇1ml；一邊加入一邊混勻，-20℃過夜；

(4)按照步驟(2)所述方法用染色洗滌液洗滌2遍；

(5)染色：取2×10⁶個(gè)細(xì)胞，加入100ul染色洗滌液，其中含有0.2ul核磷蛋白染料偶聯(lián)熒光素的有絲分裂磷蛋白抗體，37℃孵育1h；

(6)按照步驟(2)所述方法用染色緩沖液洗滌2遍；

(7)細(xì)胞用500ul?HBSS重懸，加入核酸染料Hochest33342，終濃度為2ug/ml；以及加入Pyronin?Y，終濃度為2ug/ml；37℃20分鐘；

(8)流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算細(xì)胞分別處于每個(gè)期的比例；其中Hochest33342激發(fā)發(fā)射采用355/460nm，Pyronin?Y激發(fā)發(fā)射488/560nm，有絲分裂磷蛋白抗體的激發(fā)發(fā)射通道根據(jù)熒光素來選擇，注意避開Hochest33342、Pyronin?Y這兩個(gè)通道即可。

9.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于精確測定細(xì)胞周期，其中含有：DNA染料、RNA染料、熒光標(biāo)記的有絲分裂磷蛋白抗體。

10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，其中還含有選自以下的一種或多種試劑：細(xì)胞固定液，洗滌液，細(xì)胞通透試劑，洗滌液，Hanks’平衡鹽溶液。