[發明專利]一種快速高效的叢枝菌根真菌染色的方法

有效

• 申請號: 201310205885.4
• 申請日: 2013-05-28
• 公開（公告）號: CN103411813B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: 司春燦;林英;劉雪艷;肖翔;杜道林
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

本發明涉及一種快速高效對植物根部叢枝菌根真菌進行染色觀察的方法，屬于應用微生物學領域。?

背景技術

菌根是土壤中某些真菌與植物根的共生體。叢枝菌根真菌（Arbuscular?Mycorrhizal?Fungus，AMF）是自然界中一類分布廣泛的土壤微生物，它可以與約90%的陸生維管束植物的根形成一種互惠共生體——叢枝菌根。叢枝菌根的作用主要是擴大根系吸收面積，增強對原根毛范圍外的元素（主要是磷）吸收。菌絲與植物組織互通，一方面從寄主植物中吸收糖類等有機物質作為自己的營養，另一方面又從土壤中吸收養分、水分供給植物。叢枝菌根真菌不但能夠改善寄主植物礦質營養，促進植物生長發育，還具有緩解干旱、鹽堿和溫度脅迫等多種逆境對植株造成的危害。最新的研究成果表明，自然生態系統中菌根真菌影響植物種群的競爭能力，菌根真菌的多樣性決定著植物的生物多樣性、生態系統的變化以及植物的生產力。因此菌根學逐漸的興起。而菌根生長狀況觀察與侵染率測定是菌根學研究中一項重要的基礎性工作。由于幾乎所有的菌根真菌接種試驗均會涉及到菌根發育狀況觀察與侵染率測定，因此半個多世紀以來人們十分重視其觀察與測定方法研究，相繼建立了一系列的染色法來觀察菌根真菌的發育狀況，其中應用最多的是臺盼藍染色法和酸性品紅染色法。?

酸性品紅法將根段或經過FAA固定的根系經KOH透明、乳酸或2%?（W/V）HCL酸化后置于90℃的酸性品紅染色液染色20~60?min，乳酸分色后鏡檢。該方法操作簡單，然而由于根皮層也被染上相同或略淺的顏色，導致顏色反差不明顯，并且苯酚具有一定的毒性，對身體和環境具有一定的毒害。?

臺盼藍（Trypan?blue）染色法是先將經過FAA固定的根系浸入10％（W/V）KOH溶液中，90?℃消化1～2h經過消化后根呈透明狀，然后將根浸入1％?（W/V）HCl中酸化3～5?min。將根取出沖洗干凈后，浸入0.1?％（W/V）臺盼藍（Trypan?blue）染色液中，90?℃保溫10～20?min。將根取出，沖洗掉染色液。然后將根浸泡在50％乳酸溶液中脫色。經過染色的根能夠在此溶液中保存數周時間。臺盼藍染色法染色效果穩定可靠，但是在KOH溶液透明處理時不易透明徹底，導致染色時叢枝菌根真菌與皮層之間的顏色反差小，不利于對AM真菌細微結構（如叢枝）的顯微拍照。并且固定和消化時間過長，當天不能觀察菌絲形態，不利于方便快捷的對根部的AM真菌侵染情況進行觀察研究。?

除了上述兩種方法外，氯唑黑E?染色法也用作AM真菌侵染情況的觀察研究。該法將經KOH處理的根系置于等體積的85%乳酸、甘油和水溶解的0.1%（w/v）氯唑黑E混合溶液中90?℃下浸泡1h以上，甘油脫色。鏡檢時用?2%?三氯甲醛作浮載劑。該法清晰度高、反差大，叢枝結構清晰，但氯唑黑E?被認為是致癌疑似物而存在不足。?

本發明針對當前菌根研究日趨受到重視，但是菌根染色方法存在染色效果較差并且操作時間較長的問題，通過121?℃消化縮短了操作時間，并新增H₂O₂漂白處理工藝強化了染色的清晰度和層次性，從而顯著提高了染色效率和染色效果。本方法具有方便、快捷、適應性強的特點，在菌根真菌研究領域具有很強的實際應用價值。?

發明內容

本發明的目的在于通過增加高溫（121?℃）消化和H₂O₂漂洗的步驟，對傳統的菌根真菌臺盼藍染色方法進行改進，從而縮短了總體染色時間，增強了染色效果，開發出一種方便、快捷、適應性強的菌根染色方法，解決了目前菌根研究中存在的染色層次不清、圖像模糊、操作時間過長等問題，實現菌根的快速高效染色，為菌根研究者提供一種行之有效的染色方法，具有較強的實際應用價值和科研理論價值。?

本發明的技術方案如下：?

A、固定：將采取的植物根樣在尼龍網中清洗干凈，取根樣（該專利適用性強，絕大部分草本植物、木本植物和灌木的根樣均可）置于150?ml三角燒瓶中，按每5g根樣倒入FAA固定液約50?ml，并用玻璃棒輕壓根樣，使其完全浸泡在FAA固定液中，固定4?h以上；如果采集植物根樣后可以立即進行下一步處理，則可省略該步驟；

B、消化：將采集的植物的根樣（或FAA固定液中的根樣）沖洗干凈后，將根樣置于150?ml三角燒瓶中，按每5g根樣加入10％（W/V）KOH溶液約50?ml，在121?℃高壓滅菌5~10?min，以除去根中的細胞質，經過消化后根呈透明狀，以便于染色觀察；