[發明專利]一種快速高效的叢枝菌根真菌染色的方法

有效

• 申請號: 201310205885.4
• 申請日: 2013-05-28
• 公開（公告）號: CN103411813B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: 司春燦;林英;劉雪艷;肖翔;杜道林
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司32200
• 代理人: 樓高潮

1.一種快速高效的叢枝菌根真菌染色的方法，按照下述步驟進行：

A、固定：將采取的植物根樣在尼龍網中清洗干凈，按每5g取根樣倒入FAA固定液?50?ml，并用玻璃棒輕壓根樣，使其完全浸泡在FAA固定液中，固定4?h以上；如果采集植物根樣后可以立即進行下一步處理，則可省略該步驟；

B、消化：將采集的植物的根樣或FAA固定液中的根樣沖洗干凈后，按每5g根樣加入10％W/V?KOH溶液50?ml，在121?℃高壓滅菌5~10?min，以除去根中的細胞質，經過消化后根呈透明狀，以便于染色觀察；

C、漂洗：在室溫冷卻后，將根從KOH溶液中取出，用蒸餾水沖洗干凈，若KOH處理后根的顏色為褐色或深黃色，則將根樣置于250?ml三角燒瓶中，按每5g根樣加入H₂O₂漂洗液100?ml中，H₂O₂漂洗液為分析純，有效含量不少于3%?W/V，漂白根樣5~10?min；若在消化處理后的根樣為無色或半透明狀，則可以省略漂洗步驟，直接進行下一步的酸化處理；

D、酸化：然后將根置于150?ml三角燒瓶中，按每5g根樣加入1％W/V??HCl?50?ml，酸化3～5?min；

E、染色：將根取出沖洗干凈后置于150?ml三角燒瓶中，按每5g根樣加入0.1％W/V?臺盼藍染色液50?ml，煮沸10min；

F、脫色：待冷卻后，將根取出，用蒸餾水沖洗掉染色液，然后將根置于250?ml三角燒瓶中，按每5g根樣加入50％W/V?乳酸溶液100?ml，脫色10?min以上；

G、觀察：將染色后的根段切成1?cm，于光學顯微鏡下觀察，凡出現菌絲、孢子或者叢枝等AMF結構，就將其計成已被侵染根段，計算AMF根侵染率。

2.根據權利要求1所述的快速高效的叢枝菌根真菌染色的方法，其特征在于其中所述的FAA固定液配制方法為50％W/V乙醇、甲醛、冰醋酸按體積比為85:10:5，混勻，試劑瓶盛放，常溫保存。

3.根據權利要求1所述的快速高效的叢枝菌根真菌染色的方法，其特征在于其中所述的H₂O₂漂洗液為H₂O₂，分析純，有效含量不少于3%W/V且不大于100%，稀釋10倍。

4.根據權利要求1所述的快速高效的叢枝菌根真菌染色的方法，其特征在于其中所述的脫色液為乳酸、甘油和蒸餾水按體積比為1:1:1，混勻后用試劑瓶保存。

5.根據權利要求1所述的快速高效的叢枝菌根真菌染色的方法，其特征在于其中所述的0.1％W/V臺盼藍染色液為按每0.3?g?Trypan?blue?溶于300ml脫色液中，混合均勻。

6.根據權利要求1所述的快速高效的叢枝菌根真菌染色的方法，其特征在于其中所述的根樣為草本、木本植物和灌木的根樣。

7.根據權利要求1所述的快速高效的叢枝菌根真菌染色的方法，其特征在于其中所述的根樣為酢漿草根樣、狗尾草根樣、大葉黃楊根樣或加拿大一枝黃花根樣。