[發(fā)明專利]吐溫80結(jié)合超聲波獲得叢粒藻單細(xì)胞的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310204936.1
• 申請(qǐng)日: 2013-05-29
• 公開（公告）號(hào): CN103275967A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 茅云翔;曹敏;張芳芳;孔凡娜;隋正紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N13/00
• 分類號(hào): C12N13/00;C12N1/12
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種制備叢粒藻單細(xì)胞的方法，特別涉及一種使用吐溫80和超聲波獲得叢粒藻單細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

(1)叢粒藻的研究現(xiàn)狀和研究?jī)r(jià)值

自1968年Maxwell等查明葡萄藻膠群體中充滿了由不飽和烴類物質(zhì)組成的油類物質(zhì)后，且葡萄藻所產(chǎn)烴的組成和結(jié)構(gòu)與石油極其相似，全世界微藻科研工作者對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)烴條件進(jìn)行了大量的研究。呈串狀集落生的叢粒藻(Botryococcus?braunii，又譯葡萄藻)是一種在溫帶、熱帶和大陸性氣候帶的陸地、淡水和微咸湖水等地廣為分布的光合自養(yǎng)型單細(xì)胞綠色微藻，其含烴量可高達(dá)細(xì)胞干重的86％，通常為25％-40％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它微生物的產(chǎn)烴量，因此利用葡萄藻生產(chǎn)石油替代品受到高度重視。國(guó)外早在二十世紀(jì)七十年代起就對(duì)該藻生產(chǎn)替代能源展開了一系列的研究，我國(guó)起步則較晚且一直鮮有研究。分析其主要原因是叢粒藻生長(zhǎng)緩慢、倍增時(shí)間長(zhǎng)，成為該藻實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的一大障礙。

(2)能源微藻叢粒藻培養(yǎng)和解決問題的迫切性

目前依然無法很好地實(shí)現(xiàn)其的大規(guī)模培養(yǎng)，由于藻體呈集落生長(zhǎng)，在生長(zhǎng)過程中藻體相互遮擋，影響藻體吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和光照等，緩慢的生長(zhǎng)速率是限制該藻產(chǎn)烴工業(yè)化的一大障礙。而且多個(gè)細(xì)胞在遺傳背景上不統(tǒng)一，難以通過化學(xué)或物理的方法對(duì)其進(jìn)行誘變育種的選育。同時(shí)叢粒藻是從自然界直接分離的，性狀一般較單一穩(wěn)定，在能源微藻產(chǎn)業(yè)化的過程中，在烴和脂的產(chǎn)量上很難有所突破。叢粒藻主要以分裂生殖為主要方式，很難通過有性繁殖的方式來進(jìn)行良種選育。面對(duì)這樣一種烴脂含量都很高的能源微藻，不僅培養(yǎng)成本低、產(chǎn)出高而且對(duì)環(huán)境的污染小，我們應(yīng)該致力于解決其生長(zhǎng)速度緩慢和優(yōu)良藻種的選育問題。

目前，關(guān)于叢粒藻的研究主要是集中在生理生化的相關(guān)方面，對(duì)于優(yōu)良藻種的選育以及大規(guī)模的培養(yǎng)，還未見相關(guān)報(bào)道。，在使叢粒藻從實(shí)驗(yàn)室研究培養(yǎng)走向工業(yè)化產(chǎn)業(yè)化過程中，仍然面臨一些問題：1、目前依然無法很好地實(shí)現(xiàn)其的大規(guī)模培養(yǎng)，緩慢的生長(zhǎng)速率是限制該藻產(chǎn)烴工業(yè)化的一大障礙。叢粒藻是一種呈串狀集落生長(zhǎng)的藻體，藻體是由幾十個(gè)到幾百個(gè)細(xì)胞組成的，大小在300-500μm左右，由于藻體呈集落生長(zhǎng)，在生長(zhǎng)過程中藻體相互遮擋，影響藻體吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和光照等，藻體生長(zhǎng)緩慢，倍增時(shí)間長(zhǎng)；2、叢粒藻是從自然界直接分離的，性狀一般較單一穩(wěn)定，在能源微藻產(chǎn)業(yè)化的過程中，在烴和脂的產(chǎn)量上很難有所突破；3、叢粒藻的生殖方式主要是無性生殖，以分裂生殖為主，對(duì)于優(yōu)良藻種的選育，很難通過有性繁殖的方式來進(jìn)行良種選育；4、叢粒藻的集落生長(zhǎng)狀態(tài)不僅限定了其生長(zhǎng)速率，而且多個(gè)細(xì)胞在遺傳背景上不統(tǒng)一，難以通過化學(xué)或物理的方法對(duì)其進(jìn)行誘變育種的選育。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備游離叢粒藻單細(xì)胞的方法，該方法成功獲得叢粒藻單細(xì)胞，培養(yǎng)過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和光照均一化吸收，制備時(shí)間周期短，叢粒藻單細(xì)胞獲得率高。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。

一種使用表面活性劑結(jié)合超聲波獲得叢粒藻單細(xì)胞的方法，包括以下具體步驟：

1.收集處于穩(wěn)定期的藻細(xì)胞，用表面活性劑孵育藻細(xì)胞：

叢粒藻藻細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期藻細(xì)胞由于類胡蘿卜素的積累從綠色變?yōu)榻奂t色，同時(shí)也會(huì)在代謝過程中產(chǎn)生并富集烴類和脂類，只有極少部分的烴和脂類會(huì)分泌到水環(huán)境中，顯微鏡下用鑷子輕輕按壓蓋玻片就可以看到油滴不斷地從藻體中釋放出來，用尼羅紅熒光燃料進(jìn)行染色觀察，可發(fā)現(xiàn)大量的烴和脂類物質(zhì)的積累，根據(jù)烴脂的積累，染色的顏色成橘紅色到金黃色不等。

使用篩絹排除叢粒藻在生長(zhǎng)過程中自己釋放的單細(xì)胞后，收集100ml的藻液溶于10ml的表面活性劑中；優(yōu)選使用500目篩絹，優(yōu)選表面活性劑為體積分?jǐn)?shù)為5％的吐溫80；由于叢粒藻藻細(xì)胞有自然沉降的現(xiàn)象，把裝有藻細(xì)胞的離心管放在振蕩儀器上，使藻細(xì)胞間的烴類和脂類物質(zhì)完全乳化；優(yōu)選振蕩儀器為超聲波、渦旋儀和振蕩培養(yǎng)儀器等，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為150rpm/min，孵育30min；

(2)利用超聲波的機(jī)械力對(duì)孵育完的藻細(xì)胞進(jìn)行破碎：

將(1)中表面活性劑中孵育后的藻細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎；優(yōu)選超聲功率為200w，超聲時(shí)間為5s，間隙時(shí)間為5s，總處理時(shí)間為1min；

超聲處理完以后的藻細(xì)胞，用真空抽濾泵和濾膜，進(jìn)行分離吐溫和藻細(xì)胞；優(yōu)選8μm的濾膜。

由于高濃度表面活性劑長(zhǎng)時(shí)間處理會(huì)對(duì)藻細(xì)胞有較強(qiáng)的毒害作用，通過抽濾可去除大部分的表面活性劑，抽濾完以后把留在濾膜上的藻細(xì)胞重懸在培養(yǎng)基中，優(yōu)選BG-11培養(yǎng)基，把濾膜上的藻細(xì)胞用移液器全部沖洗下來。