[發(fā)明專利]白血病融合基因的檢測(cè)方法及其引物、探針和基因芯片

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310204497.4
• 申請(qǐng)日: 2013-05-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104178557B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 熊斐斐;張春秀;張慶華;熊慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海生物芯片有限公司;上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海浦一知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 丁紀(jì)鐵

本發(fā)明公開(kāi)了一種多重RT?PCR聯(lián)合基因芯片檢測(cè)白血病融合基因的方法，步驟包括：1）抽提樣本細(xì)胞總RNA；2）RNA特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；3）多重RT?PCR擴(kuò)增cDNA；4）用含檢測(cè)白血病融合基因的特異性探針的基因芯片檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明還公開(kāi)了上述方法所用的探針、引物和基因芯片。本發(fā)明采用一管巢式多重PCR，擴(kuò)增樣本中可能含有的特異性融合基因片段，再通過(guò)基因芯片雜交和芯片掃描圖像分析，獲得融合基因檢測(cè)結(jié)果，如此實(shí)現(xiàn)了15個(gè)白血病融合基因的27種及以上不同融合形式的特異性片段的同時(shí)檢測(cè)，從而大大提高了白血病融合基因的檢測(cè)效率，有利于大規(guī)模的臨床篩選。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種多重RT-PCR聯(lián)合基因芯片檢測(cè)白血病融合基因的方法，以及該方法所用的特異性探針、引物和基因芯片。

背景技術(shù)

白血病是造血系統(tǒng)的一種惡性腫瘤，年發(fā)病率約為2.76人/10萬(wàn)人，占癌總發(fā)病數(shù)的5%，兒童及35歲以下成人惡性腫瘤死亡率排名第一位。白血病的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，往往涉及多個(gè)基因的改變，包括正常基因的突變或缺失、癌基因的異常擴(kuò)增和表達(dá)以及多個(gè)基因的協(xié)同作用，加之基因本身多效性和免疫因素，最終決定腫瘤表型是否表達(dá)。

根據(jù)病程、臨床表現(xiàn)白血病可分為兩大類(lèi)急性白血病和慢性白血病。根據(jù)母細(xì)胞來(lái)源又可將急性白血病分為急性淋巴性白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL），急性髓性白血病（Acute Myelogenous Leukemia，AML）；慢性白血病分為慢性淋巴性白血病（Chronic Lymphocytic Leukemia，CLL），慢性髓性白血病（Chronic MyelogenousLeukemia，CML）。其中以急性白血病多見(jiàn)（70％），各年齡均可發(fā)生，而且男性多于女性。成年人中最常見(jiàn)的是AML和CML，兒童中比較常見(jiàn)的是ALL。

部分白血病的發(fā)生可能與染色體易位所形成的融合基因有關(guān)，如染色體易位t(9;22)(q34;q11)BCR-ABL p190、t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4、t(12;21)(p13;q22)TEL-AML1、t(1;19)(q23;p13)E2A-PBX1可能會(huì)與ALL相關(guān)；t(8;21)(q22;q22)AML1-ETO、inv(16)(p13;q22)/t(16;16)(p13;q22)CBFB-MYH11、t(15;17)(q22;q12)PML-RARA、t(9;11)(p22;q23)MLL-AF9及其他一些11q23MLL基因重排可能會(huì)與AML相關(guān)。染色體異位形成的融合基因的檢測(cè)，結(jié)合臨床細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、骨髓象檢查等，可進(jìn)行白血病的診斷、預(yù)后和治療方面的分析。

檢測(cè)白血病染色體異常的方法主要有常規(guī)G顯帶染色體核型分析、熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和PCR技術(shù)。常規(guī)G顯帶染色體核型分析依舊是染色體遺傳病檢查的重要手段，它能夠可靠識(shí)別染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化，盡管在靈敏度和操作性上有局限，比如白血病細(xì)胞分裂指數(shù)低、染色體形態(tài)短小、常顯帶不清、隱匿型易位，使得一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜或細(xì)微的改變難以準(zhǔn)確識(shí)別。FISH是利用熒光標(biāo)記探針結(jié)合特定染色體序列，從而得以在顯微鏡下分析。通過(guò)探針熒光可以識(shí)別顯微甚至亞顯微的隱匿型結(jié)構(gòu)異常和染色體數(shù)目變化。FISH相對(duì)于核型分析更能直接觀察染色體異常，而且靈敏度更高，適用于分裂間期中期細(xì)胞，但其僅能對(duì)已知探針的基因位點(diǎn)進(jìn)行分析。PCR檢測(cè)急性白血病相當(dāng)普遍，不僅對(duì)白血病的診斷有用，而且更適用于對(duì)白血病微小殘留病灶的檢測(cè)。這些方法都具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，但是都不適合于多樣本的白血病融合基因篩查。