[發(fā)明專(zhuān)利]一種醫(yī)用軟骨支架材料的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310203720.3
• 申請(qǐng)日: 2013-05-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103301508A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙博;王振軍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京博輝瑞進(jìn)生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A61L27/36
• 分類(lèi)號(hào): A61L27/36;A61L27/56;A61L27/54
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 33228
• 代理人: 李迎春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種醫(yī)用軟骨支架材料的制備方法。

背景技術(shù)

軟骨組織由軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)組成，軟骨基質(zhì)由膠原和軟骨粘蛋白等大分子組成。軟骨組織分布于關(guān)節(jié)面、耳、鼻、椎間盤(pán)、氣管環(huán)等部位，其作用是維持關(guān)節(jié)正常功能、支撐器官形態(tài)和功能等。由于軟骨內(nèi)無(wú)血管分布，且軟骨細(xì)胞被周?chē)|(zhì)成分所包圍，因此軟骨損傷后自身修復(fù)能力極差，特別是關(guān)節(jié)軟骨損傷，通常會(huì)發(fā)生不可逆的病理過(guò)程，引起關(guān)節(jié)功能改變。如何有效地修復(fù)損傷的關(guān)節(jié)軟骨是眾所周知的難題。自體軟骨來(lái)源有限,?且容易造成供區(qū)缺損,?應(yīng)用受到限制。異體軟骨應(yīng)用可引起免疫排斥反應(yīng)，而導(dǎo)致細(xì)胞死亡及功能喪失。隨著組織工程學(xué)和生物材料學(xué)的發(fā)展，已有人工軟骨支架材料用于軟骨修復(fù)，包括聚乳酸、聚羥基乳酸、聚乳酸-?聚羥基乙酸共聚物等人工合成的高分子聚合物。但上述人工高分子材料的結(jié)構(gòu)及組成均與軟骨組織相差甚遠(yuǎn)，只能在短期內(nèi)起到替代和支撐作用，不能促進(jìn)軟骨再生，實(shí)現(xiàn)功能修復(fù)，并且，植入后均難以降解，其穩(wěn)定性、組織毒性反應(yīng)及致癌性等均難以控制。

在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，醫(yī)用軟骨支架材料正進(jìn)入重大產(chǎn)業(yè)革命時(shí)期，即從傳統(tǒng)的不可吸收材料向可降解的、能夠主動(dòng)誘導(dǎo)組織再生的新型生物材料變革。而基于組織工程學(xué)原理的以動(dòng)物組織為原料的脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular?matrix，ECM）材料是主要發(fā)展方向。ECM是由多種大分子物質(zhì)如膠原、非膠原糖蛋白、氨基聚糖、蛋白聚糖、彈性蛋白等成分，按一定比例和結(jié)構(gòu)建成的復(fù)雜的有機(jī)的三維整體，為各種細(xì)胞的生存及活動(dòng)提供適宜的場(chǎng)所和微環(huán)境，能夠調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)、形狀、代謝、遷移、增殖和分化，進(jìn)而調(diào)控組織和器官功能。組織缺損的一個(gè)嚴(yán)重后果是“土壤”—ECM的喪失，這也是機(jī)體自身無(wú)法實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)和再生的原因。天然的ECM可以作為組織再生的“土壤”，是理想的組織修復(fù)材料。去除動(dòng)物組織的細(xì)胞成分可以去除大部分的免疫原性，并保留ECM成分，可以開(kāi)發(fā)出理想的組織修復(fù)材料。因此，脫細(xì)胞ECM材料的研究成為軟骨支架材料的重點(diǎn)研究方向。

但是，到目前為止，尚沒(méi)有脫細(xì)胞ECM材料用于臨床。現(xiàn)有的脫細(xì)胞ECM材料的制備過(guò)程主要是以Courtman?等提出的四步法為基礎(chǔ)，即凍干-去污劑-酶法。此類(lèi)方法存在的問(wèn)題包括：（1）去免疫原性不徹底：由于軟骨組織是致密的硬組織，溶液無(wú)法完全滲入組織內(nèi)部，脫落的細(xì)胞碎片也無(wú)法完全洗脫，導(dǎo)致了材料里大量的細(xì)胞和細(xì)胞碎片殘留；并且，上述工藝也不能完全去除所有的動(dòng)物源性DNA成分。細(xì)胞成分和DNA的殘留會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)。（2）有毒物質(zhì)殘留：已有的工藝均使用有機(jī)去污劑和活性酶，無(wú)法完全去除，材料中均有大量殘留，上述物質(zhì)均有細(xì)胞毒性，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)和軟骨組織再生。（3）由于軟骨組織致密，上述四步法工藝制備的脫細(xì)胞ECM材料不能實(shí)現(xiàn)理想的孔隙率，細(xì)胞無(wú)法長(zhǎng)入材料內(nèi)部；為了解決這一問(wèn)題，部分改良工藝先將軟骨組織粉碎后再壓制成型，這種方法又不能實(shí)現(xiàn)軟骨組織的力學(xué)性能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種醫(yī)用軟骨支架材料的制備方法，用該方法制備的醫(yī)用軟骨支架材料完全去除了動(dòng)物源細(xì)胞成分和DNA成分，同時(shí)完整地保留了天然ECM的成分、三維結(jié)構(gòu)，無(wú)內(nèi)毒素、有機(jī)溶劑和有毒溶劑殘留，具有適應(yīng)細(xì)胞長(zhǎng)入和軟骨組織再生的孔隙率，并具有理想的力學(xué)性能。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種醫(yī)用軟骨支架材料的制備方法，包括以下操作步驟：

（1）軟骨組織的前置處理分離與初洗

取新鮮動(dòng)物的肋軟骨組織清洗潔凈，去除骨膜，切割成0.5~4cm厚的條形，使用注射用水沖洗3遍。作為優(yōu)選，所述動(dòng)物為豬、牛、馬中的一種，進(jìn)一步優(yōu)選為豬。

（2）病毒滅活

采用低濃度過(guò)氧乙酸-乙醇溶液法滅活病毒，該步驟在清洗槽可振蕩的恒溫超聲波清洗器中進(jìn)行，其中過(guò)氧乙酸的體積百分含量為0.05~0.2%（優(yōu)選為0.1%），滅活時(shí)間為1~2h（優(yōu)選為1h），溫度范圍為4~40℃，然后在磷酸鹽緩沖液中清洗2~5次，每次15min，檢測(cè)清洗后的磷酸鹽緩沖液的pH值，當(dāng)pH達(dá)到6.5-7.5后，以流動(dòng)的注射用水清洗材料，檢測(cè)電導(dǎo)率達(dá)到1.5um/s以下時(shí)終止。該步驟中磷酸鹽緩沖液的配制方法為稱(chēng)7.9g?NaCl、0.2g?KCl、0.24g?KH₂PO₄、1.8g?K₂HPO₄，溶于800?ml?蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，然后加蒸餾水定容至1?L。

（3）脫細(xì)胞