[發明專利]一種快速從土壤篩選產抗菌素的放線菌的方法

有效

• 申請號: 201310202954.6
• 申請日: 2013-05-28
• 公開（公告）號: CN103275897A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 陳國華;付桂榮;郭倩倩
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 成鋼

技術領域

本發明涉及一種抗菌素微生物篩選方法，尤其是快速地從土壤中篩選產抗菌素的放線菌的方法。

背景技術

病原細菌耐藥已經成為動植物及人類用藥中最為困擾的事件之一，并且病原菌耐藥趨勢還在上升，但是新型抗菌素的發現相對滯后，從自然界中篩選產新型抗菌素的微生物顯得尤為重要。放線菌產生的抗菌素種類占所有發現的抗菌素的三分之二左右，說明利用放線菌篩選新型抗菌素具有較高的成功幾率。土壤是微生物最豐富的環境，許多研究工作者從事土壤放線菌產生抗菌素研究。采用單菌落瓊脂塊法篩選產抗菌素的放線菌，由于單菌落分布范圍小，一個單菌落只能測試一種類型細菌：革蘭氏陰性細菌或者革蘭氏陽性細菌，這樣就會錯過評估一種放線菌對另外一類病原細菌的抑制作用，縮小了抗菌素發現范圍。有的研究人員將單菌落重新涂布接種后，用瓊脂塊進行抑菌測試（朱文杰等.?秦嶺太白山北坡土壤拮抗性放線菌分布及特性.?應用生態學報,?2011,?22(11):?3003-3010），即單菌落涂布瓊脂塊法，每個單菌落需要一個培養皿，導致工作量增大很多。?

????還有一種方法就是液體發酵法，將放線菌單菌落接種于液體培養基中，發酵培養后再測試該放線菌發酵液對革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌的抑制作用?[肖靜等，紅樹林放線菌的分離及其抗菌和抗腫瘤細胞活性.?應用與環境生物學報,?2008,?14:?244-248]。由于一個土樣可以獲得幾十個單菌落，液體發酵法工作量非常繁重，導致一定時間內篩選的土壤樣品數量減少。

產放線菌篩選工作非常龐大，目前為了從放線菌中篩選獲得新型抗菌素，在篩選培養基組成上進行了許多研究，以期篩選到稀有放線菌或常規培養方法難以培養的放線菌。然而這些放線菌的抗菌活性初篩采用單菌落瓊脂塊法、單菌落涂布瓊脂塊法和單菌落液體發酵法，使得抗菌素產生放線菌漏選或者工作量大增，從而影響了產抗菌素放線菌的發現機會，制約了新型抗菌素的研究開發。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種以長方形轉接，其中一個10cm的培養皿可以轉接多達35個單菌落，采用瓊脂塊抑菌測試，可以同時測試兩類細菌（革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌）的方法。為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：

1）土壤樣本的采集及處理：采集新鮮土壤，放入50mL滅菌塑料袋中，立即帶回實驗室，稱取濕重樣品5g于80℃烘干恒重，計算出5g干重土樣所需濕重量。

2）培養：將步驟1）采集的相當于干重5g的濕重樣本經梯度稀釋后在65℃水浴恒溫10min，接種于含有高氏一號培養基的培養皿里，培養6-12天；

3）挑選單菌落：將步驟2）中形成的單菌落數量最多培養皿中所有的單菌落挑選出來進行轉接；

4）長方形轉接：將步驟3）所有單菌落編號，用接種環轉接至新的高氏一號培養基上，劃短線轉接到新培養基中，28℃培養12天，其中每個短線之間距離為6-10mm，每個10cm的培養皿至少可以轉接35個單菌落；

5）篩選：用直徑為4mm的不銹鋼打孔器將生長放線菌的瓊脂培養基打成2塊圓形的瓊脂培養基塊，用鑷子分別夾取瓊脂培養基塊放置于預先涂布測試革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌的培養基上，培養18-24?h，觀察抗菌活性，產生透明圈的即為有抗菌活性，抗菌活性大小R=透明圈直徑D-瓊脂塊直徑d；

6）將產生透明圈瓊脂塊的原始單菌落重復步驟4）、5）再次進行劃線分離純化，得到穩定的產抗菌素的放線菌。

本發明的優點：本發明采用將單菌落以長方形轉接方式接種提高了發現抗菌素產生放線菌的速度，具有操作方便、迅速的優勢，能方便、快捷地從土壤中初步篩選產抗菌素的放線菌菌株，可替代單菌落瓊脂塊法、單菌落涂布瓊脂塊和單菌落液體發酵法而廣泛推廣使用。

具體實施方式

實施例1

一種快速從土壤中篩選產抗菌素的放線菌的方法，該方法包括以下步驟：

1）采集樣本：從三峽水庫香溪河段香溪鎮附近采集土壤樣本，放入50ml的滅菌塑料管中，立即將樣本帶回實驗室；

2）培養：培養基是高氏一號合成培養基；