[發明專利]鱖魚腦細胞系的構建方法

有效

• 申請號: 201310202902.9
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103275925A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 付小哲;李寧求;吳淑勤;羅霞;賴迎迢;石存斌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12R1/91
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 張萍

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種鱖魚腦細胞系的構建方法。

背景技術

鱖（Siniperca?chuatsi），又名桂花魚，肉質細嫩、味道鮮美，在國際水產品市場中有“淡水石斑”之稱，是我國優質淡水魚消費和出口創匯的重要品種之一。隨著鱖魚養殖規模的逐年擴大和養殖密度的提高，鱖魚疾病繁多，病原包括病毒、細菌、寄生蟲等，尤其是由傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）引起的病毒病最為嚴重，發病率普遍達60%以上，死亡率50%以上，嚴重時發病塘鱖魚死亡率達90%，甚至全部死亡，每年因其造成的經濟損失達十億元以上，嚴重影響了鱖魚養殖業的可持續發展。查清病毒的感染途徑及病毒與細胞相互作用機理是從根本上預防和解決鱖魚等魚類病毒病的關鍵。細胞系作為一種體外培養系統，因其成本低、可重復性好、條件可控等優點，被廣泛應用于病毒學、免疫學、毒理學、發育生物學、生理學、腫瘤學、基因組學、蛋白組學、遺傳學等領域，尤其是在研究病毒感染途徑、感染機理以及研制病毒疫苗方面是重要的研究工具。

前期研究發現，就ISKNV敏感性而言，鱖魚腦細胞比鱖魚鰭條細胞、吻端細胞、腎臟細胞、肝臟細胞更敏感。而成熟魚體大腦組織細胞很多已經分裂不旺盛或者不分裂，且目前采用的魚類細胞系構建方法中，快速剪碎組織法會產生機械剪切力，會對腦細胞產生很大影響，使腦原代細胞難以正常貼壁并增殖，而胰蛋白酶消化分離法會使大量的腦細胞在胰蛋白酶消化過程中缺氧死亡，因此需要研究一種有效的鱖魚腦細胞系的構建方法，建立鱖魚腦細胞系，為在細胞水平上研究病毒致病機理、研制抗病毒藥物及抗病毒疫苗奠定基礎。迄今為止，有文獻報道采用胰蛋白酶消化分離法建立了一株鱖魚幼魚細胞系（中山大學，董傳甫，Virus?Research，2008，135：273–281），但仍未見腦來源細胞系的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種鱖魚腦細胞系的構建方法。

本發明所采取的技術方案是：

鱖魚腦細胞系的構建方法，包括以下步驟：

1)腦組織的處理：取鮮活鱖魚，無菌條件下剖取鱖魚腦組織，剪成50～100立方毫米的組織塊；

2)原代培養：將組織塊放入含血清的膠原酶消化液中消化4～6小時，離心收集經消化處理的組織細胞懸液，加入鱖魚腦細胞專用增殖培養液重懸后，于25～28℃培養箱中培養，每3～5天半量更換培養液一次；

3)傳代培養：原代培養細胞長成單層后，加入胰蛋白酶消化，然后用鱖魚腦細胞專用增殖培養液懸起細胞，按1瓶傳2瓶的方式進行傳代培養。

優選的，所述的含血清的膠原酶消化液為含有10～20v/v%胎牛血清、0.1～0.2w/v%Ⅰ型膠原酶、200～400U/ml青霉素、200～400μg/ml鏈霉素、0.5～1.0μg/ml兩性霉素B的L-15培養液。

優選的，所述的鱖魚腦細胞專用增殖培養液為含有20v/v%胎牛血清、10～20ng/ml人表皮生長因子、10～20ng/ml人堿性成纖維生長因子、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、0.25μg/ml兩性霉素B，pH值為7.0～7.4的L-15培養液。

優選的，當細胞傳代培養至5代后，所用鱖魚腦細胞專用增殖培養液中不再添加人表皮生長因子、人堿性成纖維生長因子及抗生素，胎牛血清濃度降至10v/v%。

優選的，步驟1）中，首先將鮮活幼鱖用70～75v/v%酒精浸泡消毒2～3分鐘，擦除體表粘液，然后在無菌條件下解剖取下腦組織，在1×HBSS平衡液中將腦組織剪成50～100立方毫米的組織塊，500～600轉/分離心收集組織塊，離心2～3次。

優選的，步驟2）中，將組織塊放入含血清的膠原酶消化液中，25～30℃下進行消化。

優選的，步驟2）中，1200～2200轉/分離心5～10分鐘，收集經消化處理的組織細胞懸液。

優選的，步驟3）中，待鱖魚腦細胞長成單層后，吸出培養瓶中的培養液，用HBSS平衡液洗滌2～3次，向培養瓶中加入濃度為0.1～0.25w/v%的胰蛋白酶溶液，室溫靜置消化1～2分鐘后，吸去胰蛋白酶溶液，然后加入鱖魚腦細胞專用增殖培養液，制成細胞懸液；從每個培養瓶中分別取出一半的腦細胞懸液，分別加入到新的培養瓶中；待腦細胞再次長成單層后，仍以上述相同方法進行傳代培養，至細胞系建立。

本發明的有益效果是：