[發明專利]鱖魚腦細胞系的構建方法

有效

• 申請號: 201310202902.9
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103275925A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 付小哲;李寧求;吳淑勤;羅霞;賴迎迢;石存斌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12R1/91
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 張萍

1.鱖魚腦細胞系的構建方法，包括以下步驟：

1）腦組織的處理：取鮮活鱖魚，無菌條件下剖取鱖魚腦組織，剪成50～100立方毫米的組織塊；

2）原代培養：將組織塊放入含血清的膠原酶消化液中消化4～6小時，離心收集經消化處理的組織細胞懸液，加入鱖魚腦細胞專用增殖培養液重懸后，于25～28℃培養箱中培養，每3～5天半量更換培養液一次；

3）傳代培養：原代培養細胞長成單層后，加入胰蛋白酶消化，然后用鱖魚腦細胞專用增殖培養液懸起細胞，按1瓶傳2瓶的方式進行傳代培養。

2.根據權利要求1所述的鱖魚腦細胞系的構建方法，其特征在于：所述的含血清的膠原酶消化液為含有10～20v/v%胎牛血清、0.1～0.2w/v%Ⅰ型膠原酶、200～400U/ml青霉素、200～400μg/ml鏈霉素、0.5～1.0μg/ml兩性霉素B的L-15培養液。

3.根據權利要求1所述的鱖魚腦細胞系的構建方法，其特征在于：所述的鱖魚腦細胞專用增殖培養液為含有20v/v%胎牛血清、10～20ng/ml人表皮生長因子、10～20ng/ml人堿性成纖維生長因子、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、0.25μg/ml兩性霉素B，pH值為7.0～7.4的L-15培養液。

4.根據權利要求1或3所述的鱖魚腦細胞系的構建方法，其特征在于：當細胞傳代培養至5代后，所用鱖魚腦細胞專用增殖培養液中不再添加人表皮生長因子、人堿性成纖維生長因子及抗生素，胎牛血清濃度降至10v/v%。

5.根據權利要求1所述的鱖魚腦細胞系的構建方法，其特征在于：步驟1）中，首先將鮮活幼鱖用70～75v/v%酒精浸泡消毒2～3分鐘，擦除體表粘液，然后在無菌條件下解剖取下腦組織，在1×HBSS平衡液中將腦組織剪成50～100立方毫米的組織塊，500～600轉/分離心收集組織塊，離心2～3次。

6.根據權利要求1或2所述的鱖魚腦細胞系的構建方法，其特征在于：步驟2）中，將組織塊放入含血清的膠原酶消化液中，25～30℃下進行消化。

7.根據權利要求6所述的鱖魚腦細胞系的構建方法，其特征在于：步驟2）中，1200～2200轉/分離心5～10分鐘，收集經消化處理的組織細胞懸液。

8.根據權利要求4所述的鱖魚腦細胞系的構建方法，其特征在于：步驟3）中，待鱖魚腦細胞長成單層后，吸出培養瓶中的培養液，用HBSS平衡液洗滌2～3次，向培養瓶中加入濃度為0.1～0.25w/v%的胰蛋白酶溶液，室溫靜置消化1～2分鐘后，吸去胰蛋白酶溶液，然后加入鱖魚腦細胞專用增殖培養液，制成細胞懸液；從每個培養瓶中分別取出一半的腦細胞懸液，分別加入到新的培養瓶中；待腦細胞再次長成單層后，仍以上述相同方法進行傳代培養，至細胞系建立。