[發(fā)明專利]一種齊考諾肽的固相合成方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310202216.1
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103242441A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 董守良;曹碩;陳強;常民;彭雅麗
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇施美康藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/02
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種齊考諾肽的固相合成方法。

背景技術(shù)

齊考諾肽(ziconotide)是ω-芋螺毒素MVIIA的合成形式，天然型存在于南太平洋海洋蝸牛(Conusmagus)體內(nèi)，是由25個氨基酸組成的陽離子多肽，包括3對二硫鍵連接的6個半胱氨酸殘基，分子量為2639.12。

它是強效的、特異性、選擇性、可逆的的N型電壓敏感性鈣通道(N-type?voltage-sensitive?calcium?channels,N-type?VSCCs)阻滯劑，可阻止脊髓初級疼痛傳入神經(jīng)元上鈣離子的涌入，抑制神經(jīng)遞質(zhì)如P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽以及谷氨酸等的釋放，從而阻止或降低疼痛信號的傳導(dǎo)，對其他離子通道沒有明顯的親和力。鞘內(nèi)注射齊考諾肽可以阻斷初級傷害感受器的傳入神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，同時阻止疼痛信號從脊髓向腦部傳導(dǎo)，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。長期給藥不會引起耐受性，優(yōu)于鞘內(nèi)注射嗎啡，可用于治療難治性、阿片類藥物無效或已產(chǎn)生耐藥性的病例。一系列的臨床實驗已經(jīng)證明鞘內(nèi)注射齊考諾肽可以治療帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛，幻肢痛，HIV相關(guān)神經(jīng)病理性疼痛，難治性癌痛，手術(shù)后疼痛。而且齊考諾肽不與阿片受體、膽堿能受體、單胺類受體或肽能受體結(jié)合。

此外，齊考諾肽仍存在部分副作用，表現(xiàn)為：頭暈，惡心，眼球震顫，步態(tài)異常，便秘，尿潴留，嗜睡，體位性低血壓，嘔吐，思維混亂，視力異常。頭暈，惡心，思維混亂，頭痛最為常見。通過劑量調(diào)整和緩慢滴定，其副作用是可控，可逆的。有精神病史的病人不能用齊考諾肽治療。對有精神缺陷、幻覺情緒改變的病人要嚴(yán)密監(jiān)護。如果有精神問題發(fā)生，應(yīng)當(dāng)終止齊考諾肽治療并改用精神藥物治療。

2004年美國食品及藥物管理局批準(zhǔn)其用于鞘內(nèi)注射治療，主要適用于其他治療方法不能耐受或不能控制的嚴(yán)重慢性疼痛患者。在歐洲，齊考諾肽也被允許用于嚴(yán)重慢性疼痛患者的治療。2007年，聯(lián)合鎮(zhèn)痛會議專門小組推薦齊考諾肽作為一線鞘內(nèi)鎮(zhèn)痛藥物。

生物提取現(xiàn)受到現(xiàn)有有限生物資源的影響，提取過程較繁瑣，效率低，且比較難得到高純度的產(chǎn)物。低溫自然成環(huán)反應(yīng)屬于熱力學(xué)控制，環(huán)化過程慢，過程控制較復(fù)雜，反應(yīng)收率低。

齊考諾肽的合成技術(shù)主要是液態(tài)合成法，很少有固相合成法的報道。其相關(guān)專利主要集中在藥理和治療方面，如US2007269528，US2006234936，LU91181。

2007年中國專利局公布一篇相關(guān)專利CN101412752A介紹了一種采用Fmoc策略固相合成齊考諾肽的方法[1]，合成路線如下：該方法以Fmoc-Rink?Amide-MBHA樹脂為固相載體，以HOBt和DIC為縮合劑，依次將側(cè)鏈保護的氨基酸連到樹脂上，得到含25個氨基酸的線性全保護肽樹脂，其中形成二硫鍵的三組Cys分別由Trt、Acm、Mob保護，不同組Cys由不同的保護基保護，同組Cys由同一種保護基保護。將線性全保護肽樹脂溶于1％的TFA/DCM溶液，室溫反應(yīng)20分鐘脫去Trt保護基，過濾后加入水、乙腈、DMSO（體積比10:15:1），稀氨水調(diào)節(jié)pH至8，室溫下攪拌反應(yīng)4小時，得到齊考諾肽一環(huán)肽樹脂。將得到的一環(huán)肽樹脂中加入0.4mmol/ml的碘/甲醇溶液，室溫反應(yīng)2小時，洗滌過濾得到齊考諾肽二環(huán)肽樹脂。將得到的二環(huán)肽樹脂溶于三氟醋酸、三氟甲磺酸、硫代苯甲醚、乙二硫醇（體積比：80:8:8:4）混合溶液中，室溫反應(yīng)3小時，過濾沉淀后得到齊考諾肽二環(huán)肽粗品。將得到的二環(huán)肽粗品溶于水中，調(diào)pH至8，雙氧水存在下室溫反應(yīng)一小時，得到齊考諾肽三環(huán)粗肽，HPLC制備純化得到齊考諾肽。

整個合成過程反應(yīng)流程如圖1所示。

該方法的優(yōu)勢在于采用純固相方法，操作比較簡單。但是，在固相條件下完成前兩個二硫鍵的氧化，重復(fù)難度很大；切割肽樹脂時，容易導(dǎo)致兩對二硫鍵的斷裂和重排而使產(chǎn)物純化復(fù)雜；最后一步雙氧水作用的環(huán)化過程中肽濃度要求非常低，不適于商品化大規(guī)模生產(chǎn)，并且該過程很容易形成二聚物或多聚物。