[發明專利]一種齊考諾肽的固相合成方法

無效

• 申請號: 201310202216.1
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103242441A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 董守良;曹碩;陳強;常民;彭雅麗
• 申請（專利權）人: 江蘇施美康藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/02
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，所述方法包括如下順序步驟：

(1)以Fmoc-氨基樹脂為固相載體，從C端到N端依次縮合反應連接25個側鏈保護的氨基酸，得到25個氨基酸的線性全保護肽樹脂，其中，形成二硫鍵的三組Cys分別連接Trt、Acm或tBu保護基，同組的Cys連接相同保護基，不同組的Cys連接不同的保護基；

(2)將步驟(1)得到的線性全保護肽樹脂進行線性切割，切割的同時脫去除Cys(Acm)和Cys(tBu)外的其它所有氨基酸的側鏈保護基，得到含Cys(Acm)和Cys(tBu)的線性肽；

(3)氧化步驟(2)得到的線性肽形成第一對二硫鍵，得到單二硫環肽；

(4)脫除步驟(3)得到的單二硫環肽中Cys(Acm)的Acm保護基，同時環化形成第二對二硫鍵，得到雙二硫環肽；

(5)脫除步驟(4)得到的雙二硫環肽中Cys(tBu)的tBu保護基，同時環化形成第三對二硫鍵，得到三二硫環肽；

(6)步驟(5)得到的三二硫環肽經HPLC純化、凍干得到齊考諾肽。

2.根據權利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的氨基樹脂為Rink?Amide樹脂、Rink?Amide-MBHA樹脂、Rink?Amide-BHA樹脂、Rink?Amide-AM樹脂、PAL樹脂、Knorr樹脂或Sieber樹脂。

3.根據權利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(1)中，以Fmoc-氨基樹脂為固相載體，從C端到N端依次縮合反應連接如下25個側鏈保護的氨基酸：Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Cys(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Thr-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Cys(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，得到的25個氨基酸的線性全保護肽樹脂如下：

NH₂-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Cys(tBu)-Ser(tBu)-Gly–Thr-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Cys(tBu)-Lys(Boc)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-NH-Rink?Amide?MBHA樹脂。

4.根據權利要求1或2或3所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(1)中，從C端到N端依次縮合反應連接25個側鏈保護的氨基酸，得到25個氨基酸的線性全保護肽樹脂，方法為：按1∶(4～8)∶(4～8)的摩爾比分別稱取溶脹后的氨基樹脂、Fmoc保護氨基酸、偶聯劑，將Fmoc保護氨基酸和偶聯劑溶于二甲基甲酰胺，預活化，然后加入溶脹后并已經脫除Fmoc保護基的氨基樹脂，室溫震蕩反應0.5～3小時連接Fmoc保護氨基酸，連接下一個氨基酸前用哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脫Fmoc保護基3次，時間分別為3～5分鐘、3～5分鐘、15～25分鐘，每次連接一個氨基酸之后和脫除Fmoc保護基之后都需用二氯甲烷和二甲基甲酰胺交替洗滌3～10次，用量為5～10ml/g樹脂；

其中，所述的偶聯劑為DIC與組分A摩爾當量比為1：2的混合物，或組分A、組分B和組分C三者摩爾當量比為1:1:2的混合物，其中組分A為HOBt或HOAt，組分B為HBTU、HATU、TBTU或PyBOP，組分C為DIPEA或TMP。