[發(fā)明專利]齊考諾肽的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310202089.5
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103304655A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭德文;童光彬;文永均;韓玉
• 申請（專利權(quán)）人: 成都圣諾生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/02
• 代理公司: 成都虹橋?qū)＠聞?wù)所(普通合伙) 51124
• 代理人: 梁鑫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于多肽藥物制備方法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及齊考諾肽的制備方法。

背景技術(shù)

齊考諾肽具有以下的結(jié)構(gòu)：

齊考諾肽是人工合成的ω-芋螺毒素MVIIA，是由25個氨基酸組成的聚陽離子多肽,其中包括由3個二硫鍵連接的6個半胱氨酸殘基。分子量為2639.12。它是特異性、選擇性的Ｎ型電壓敏感性鈣通道阻滯劑,對其他離子通道沒有明顯的親和力。齊考諾肽的效果比嗎啡還要強(qiáng)100到1000倍，是一種高度專一性的止痛藥。

本品為含有3個二硫鍵和25個氨基酸的多肽，是首個應(yīng)用于臨床的具有神經(jīng)元特異性的N型電壓敏感型性鈣通道阻滯劑。本品與位于脊髓背角淺層的初級傷害性傳入神經(jīng)上的N-型鈣通道結(jié)合，抑制初級傳人神經(jīng)末梢興奮性遞質(zhì)的釋放，具有抗傷害感受作用。本品不與阿片受體結(jié)合，其藥理作用也不被阿片受體拮抗劑所阻斷。在動物模型中，本品可改變阿片引起的胃腸動力降低，但不能改善嗎啡引起的呼吸抑制。給大鼠鞘內(nèi)注射本品，同時給予嗎啡、巴氯芬或可樂定，鎮(zhèn)痛作用增強(qiáng)。本品與嗎啡合用，不能防止大鼠對嗎啡的耐受性。慢性疼痛患者鞘內(nèi)滴注本品1～10mg，1h后腦脊液中藥代動力學(xué)顯示，藥時曲線下面積(AUC)和峰濃度(Cmax)呈劑量依賴性，表觀分布容積為(155±263)ml，清除率(CL)為(0.38±0.56)ml/min，消除半衰期(t1/2)為(4.6±0.9)h。本品血漿蛋白結(jié)合率為50%，表觀分布容積與腦脊液體積相近(140m1)。本品可被內(nèi)肽酶和肽鏈端解酶切開，本品進(jìn)人體循環(huán)后可被存在于多種器官中的肽酶/蛋白酶溶蛋白性裂解，成為肽類片段或游離氨基酸。經(jīng)尿液排出的原藥不足1%。本品用于適合鞘內(nèi)注射并且對其他治療(如全身鎮(zhèn)痛藥、輔助治療或鞘內(nèi)注射嗎啡)不能耐受或無效的嚴(yán)重慢性疼痛患者。

國內(nèi)外關(guān)于齊考諾肽制備報道很少。其中，中國專利201110139661.9、200710301598.8和200910188686.0所報道的制備方法均采用固相合成法，以Rink?Amide樹脂為起始原料，以單個Fmoc保護(hù)的氨基酸為原料，依次逐個接上氨基酸，然后經(jīng)過裂解、氧化和純化，獲得齊考諾肽，這些專利的側(cè)重點(diǎn)為選擇性氧化。

上述制備方法存在以下不足：由于Gly的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，接入Gly時會發(fā)生多接入一個Gly或漏接一個Gly的副反應(yīng)，所以在制備齊考諾肽過程中，在接入Gly時會產(chǎn)生[+1Gly]-齊考諾肽、[-1Gly]-齊考諾肽雜質(zhì)，從而降低粗品純度，這些雜質(zhì)極性與齊考諾肽非常接近，增大粗品純化難度，降低了產(chǎn)品收率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有方法制備的齊考諾肽雜質(zhì)多、分離純化困難、產(chǎn)品的總收率和純度低。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供一種齊考諾肽的制備方法，該制備方法使用了含Gly的保護(hù)氨基酸片段，避免了[+1Gly]-齊考諾肽、[-1Gly]-齊考諾肽雜質(zhì)的產(chǎn)生；提高粗品純度，降低粗品純化難度，縮短生產(chǎn)周期。

齊考諾肽的制備方法，包括：采用固相多肽合成法制備齊考諾肽線性肽樹脂，齊考諾肽線性肽樹脂再酸解得到齊考諾肽線性肽粗品，齊考諾肽線性肽粗品氧化后得到齊考諾肽粗品，最后齊考諾肽粗品純化得到齊考諾肽純品；其中固相多肽合成法制備齊考諾肽線性肽樹脂的步驟為：從氨基樹脂開始，通過固相偶聯(lián)合成法依次接入下列序列中對應(yīng)片段的Fmoc-保護(hù)氨基酸，制備齊考諾肽線性肽樹脂：

R-Cys(Trt)-X(Boc)-X(Boc)-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-

Arg(Pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-

Y(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Z(tBu)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-氨基樹脂；

其中：R為Fmoc、Boc或H，X為Lys-Gly,Y為Thr-Gly,Z為Ser-Gly。

優(yōu)選的，接入X時，對應(yīng)的保護(hù)氨基酸為Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH。

優(yōu)選的，接入Y時，對應(yīng)的保護(hù)氨基酸為Fmoc-Thr(tBu)-Gly-OH。

優(yōu)選的，接入Z時，對應(yīng)的保護(hù)氨基酸為Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH。

優(yōu)選的，上述齊考諾肽的制備方法中，所述Fmoc-保護(hù)氨基酸的用量為所投料樹脂總摩爾數(shù)的1.2～6倍，優(yōu)選為2.5～3.5倍。