[發(fā)明專利]一種檢測(cè)DNA損傷誘導(dǎo)的早期核仁應(yīng)激的試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310201625.X
• 申請(qǐng)日: 2013-05-27
• 公開（公告）號(hào): CN103293321A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金雅瓊;李淑艷;賈弘禔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;韓小雷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)DNA損傷誘導(dǎo)的早期核仁應(yīng)激的試劑盒及其應(yīng)用，具體涉及通過免疫熒光定量檢測(cè)E2F1在細(xì)胞核仁和核基質(zhì)的比值的方法判定DNA損傷誘導(dǎo)的早期核仁應(yīng)激，屬于檢測(cè)試劑盒領(lǐng)域。

背景技術(shù)

核仁一直被認(rèn)為是核糖體合成加工的場(chǎng)所。核仁是一個(gè)在普通光學(xué)顯微鏡下就能觀察到的細(xì)胞器。在電子顯微鏡下，核仁可被分為三層——纖維中心、致密纖維組分和顆粒組分。2006年，核仁蛋白質(zhì)組學(xué)分析將核仁中350種蛋白拓展到750種。而2009年，這一數(shù)據(jù)庫(kù)將核仁蛋白更新到4500種以上。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日益成熟、高通量技術(shù)的發(fā)展、表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)核仁不僅僅是一個(gè)進(jìn)行核糖體亞基裝配的區(qū)域，它還參與細(xì)胞周期調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、衰老、腫瘤、病毒感染等多種人類疾病過程。各種細(xì)胞脅迫（包括DNA損傷）可引起核仁結(jié)構(gòu)紊亂及功能失調(diào)，發(fā)生核仁應(yīng)激。DNA損傷造成的核仁應(yīng)激對(duì)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及對(duì)維持基因組的穩(wěn)定性具有重要的意義。利用生理生化、分子和細(xì)胞生物學(xué)手段研究DNA損傷對(duì)核仁應(yīng)激影響剛剛引起相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)家的關(guān)注。

E2F1（或E2F-1，以下統(tǒng)稱E2F1）屬E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)控、自噬以及在DNA損傷反應(yīng)中促進(jìn)細(xì)胞凋亡均具有重要意義。E2F1可通過轉(zhuǎn)錄激活很多與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白R(shí)B和其他口袋蛋白家族成員p107、p130與E2F1發(fā)生相互作用，調(diào)節(jié)E2F1的轉(zhuǎn)錄活性。RB-E2F1復(fù)合物的解離可釋放、激活E2F1，進(jìn)而激活E2F1調(diào)節(jié)的下游靶基因，從而促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期過渡。E2F1除了在細(xì)胞周期調(diào)控中扮演重要角色外，在DNA損傷反應(yīng)中也起重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，E2F1也是一種核仁轉(zhuǎn)錄因子，參與核仁內(nèi)核糖體DNA轉(zhuǎn)錄。

近年來，免疫熒光染色技術(shù)的發(fā)展非常迅速。在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)研究中，人們常常采用免疫熒光標(biāo)記B23、Fibrillarin、p14ARF等核仁蛋白，來示蹤核仁結(jié)構(gòu)。但是，DNA損傷誘導(dǎo)的核仁應(yīng)激的情況下，尚沒有核仁應(yīng)激標(biāo)志物提示核仁應(yīng)激。雖然可以采用電子顯微鏡觀察核仁結(jié)構(gòu)的變化提示DNA損傷誘導(dǎo)核仁應(yīng)激，但是此種方法十分費(fèi)力，不能將測(cè)量數(shù)據(jù)量化，對(duì)材料、設(shè)備的要求很高。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)在DNA損傷誘導(dǎo)的早期核仁應(yīng)激的過程中，E2F1在核仁中高度聚集；而在DNA損傷誘導(dǎo)的晚期核仁應(yīng)激的過程中，E2F1在核仁中聚集降低。由此可見，E2F1在核仁中高度聚集可作為DNA損傷誘導(dǎo)的早期核仁應(yīng)激的標(biāo)志性事件。由此，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)DNA損傷誘導(dǎo)的早期核仁應(yīng)激的試劑盒及其應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種檢測(cè)DNA損傷誘導(dǎo)的早期核仁應(yīng)激的試劑盒，包括：一抗標(biāo)記E2F1特異性抗體、對(duì)應(yīng)一抗來源的熒光二抗、固定液、透化液、封閉液、細(xì)胞核染料、封片劑、陽(yáng)性對(duì)照。優(yōu)選的，所述的一抗標(biāo)記E2F1特異性抗體為一抗標(biāo)記兔來源多克隆E2F1抗體，所述的熒光二抗Alexa?Fluor488標(biāo)記的羊抗兔Ig?G。

優(yōu)選的，所述的固定液為由pH7.2-7.4的PBS配制的4%多聚甲醛；

所述的透化液為含有0.5%Triton-X100的pH7.2-7.4的PBS（PBST）；

所述的封閉液為含有0.2%Triton-X100的pH7.2-7.4的PBS配制的5%BSA（Albumin?From?Bovine?Serum，牛血清白蛋白）；

所述的細(xì)胞核染料為Hoechst33342；

所述的封片劑為甘油與pH7.2-7.4的PBS的體積比例為9:1；

所述的陽(yáng)性對(duì)照為阿霉素（Adriamycin）。

上述的試劑盒在制備檢測(cè)DNA損傷誘導(dǎo)的早期核仁應(yīng)激試劑中的應(yīng)用；

上述的試劑盒在檢測(cè)DNA損傷誘導(dǎo)的早期核仁應(yīng)激中的應(yīng)用，操作步驟如下：

1免疫熒光法標(biāo)記E2F1和DNA

將制備好的細(xì)胞中加入一抗標(biāo)記E2F1特異性抗體及對(duì)應(yīng)一抗來源的熒光二抗，然后棄去二抗孵育液，加入Hoechst33342對(duì)DNA進(jìn)行標(biāo)記。

2熒光顯微鏡測(cè)量E2F1在核仁與核基質(zhì)中免疫熒光強(qiáng)度比值

當(dāng)檢測(cè)樣品的比值大于對(duì)照樣品的比值時(shí)，且單因素方差分析或T檢驗(yàn)結(jié)果有顯著性差異則DNA損傷誘導(dǎo)的核仁應(yīng)激發(fā)生。

優(yōu)選的，所述的一抗標(biāo)記為兔來源多克隆E2F1抗體，所述的熒光二抗為AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗兔Ig?G。