[發(fā)明專利]哈工大異養(yǎng)硝化不動細菌L7產(chǎn)低溫羥氨氧化酶的方法及其分離純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310201283.1
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103374556A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發(fā)明（設計）人: 李偉光;張多英;黃曉飛;秦雯
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業(yè)大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

技術領域

本發(fā)明涉及產(chǎn)酶的方法及其分離純化方法。

背景技術

生物脫氮是目前國內外公認的最為有效、最具應用前景的去除水中氨氮污染的技術，也是當前水污染控制領域的研究重點與熱點。無論是自養(yǎng)硝化菌還是異養(yǎng)硝化菌，在氨氮降解過程中，都會受到溫度影響。環(huán)境溫度降低將導致氨氮降解效果變差，尤其當溫度低于15℃時，微生物停止生長而使得氨氮無法得到降解。我國北方地區(qū)冬季水溫通常低于10℃，以黑龍江省為例，冬季水溫最低在2℃以下，低溫使氨氮去除成為難題。

水中的氨氮降解過程是由一系列氧化還原酶組成的電子傳遞鏈完成，其中羥胺氧化酶(Hydroxylamine?oxidoreductase，HAO)將氨氮氧化形成的羥胺(NH₂OH)氧化成亞硝酸態(tài)氮(NO₂^--N)，在氨氮降解過程中起關鍵作用。自養(yǎng)硝化細菌(Nitrosomonas?europaea)中的HAO存在于細胞周質中，是大約180kDa的血紅素蛋白，包含3個63kDa的α亞基和3個11kDa的β亞基(Hooper，A.in?Autotrophic?Bacteria?Biochemistry?of?the?Nitrifying?Lithoautotrophic?Bacteria；Schlegel?and?Bowien，Eds，；Scinence?Tech?Publishers：Madison，WI1989；Chapter13，pp239-265)。在異養(yǎng)硝化菌中也分離出了HAO，但是不同菌株的HAO具有特異性。在異養(yǎng)硝化菌Thiosphaera?pantotropha和Alcaligenes?faecalis中分離出的HAO是20kDa的小型單體蛋白，存在于細胞周質中(Wehrfritz，J.M.，Reilly?A.，Spiro?S.et?al.Purification?of?hydroxylamine?oxidase?from?Thiosphaera?pantotropha?identification?of?electron?acceptors?that?couple?heterotrophic?nitrification?to?aerobic?denitrification.FEBS，1993，335：246-250；Otte，S.，Schalk，J.，Kuenen，J.G.et?al.Hydroxylamine?oxidation?and?subsequent?nitrous?oxide?production?by?the?heterotrophic?ammonia?oxidizer?Alcaligenes?faecalis.Appl?Microbiol?Biotechnol，1999，51：255-261)。在異養(yǎng)硝化菌Pseudomonas?PB16中分離出的HAO是一個分量為132kDa的二聚體，含有兩個68kDa的α亞基(Jetten?M.S.M.，de?Bruiin?P.，Kuenen?J.G.Hydroxylamine?metabolism?in?Pseudomonas?PB16：involvement?of?a?novel?hydroxylamine?oxidoreductase.Antonie?van?Leeuwenhoek，1997，71：69-74)。以上分離出的HAO酶最適反應溫度為25-35℃，在低溫條件下，酶促反應速度迅速下降，成為低溫下氨氮降解效果差的主要原因之一。因此，提高低溫下羥氨氧化酶活性，分離低溫下高活性羥氨氧化酶，對解除低溫抑制作用，提高氨氮降解效果，具有重要意義。

發(fā)明內容

本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有低溫氨氮無法有效去除的問題，而提供哈工大異養(yǎng)硝化不動細菌L7產(chǎn)低溫羥氨氧化酶的方法及其分離純化方法。

哈工大異養(yǎng)硝化不動細菌L7產(chǎn)低溫羥氨氧化酶的方法，按以下步驟進行：