[發明專利]哈工大異養硝化不動細菌L7產低溫羥氨氧化酶的方法及其分離純化方法

有效

• 申請號: 201310201283.1
• 申請日: 2013-05-27
• 公開（公告）號: CN103374556A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 李偉光;張多英;黃曉飛;秦雯
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

1.哈工大異養硝化不動細菌L7產低溫羥氨氧化酶的方法，其特征在于它按以下步驟進行：

將哈工大異養硝化不動細菌L7(Acinetobacter?Heteronitrifihit?L7)菌株接種到產酶培養基中，接種量為2％，在160rpm/min、15℃培養14～24h，即完成哈工大異養硝化不動細菌L7產低溫羥氨氧化酶；其中產酶培養基的組分如下：NH₄Cl0.1g/L、CH₃CH₂ONa1.0g/L、NH₂OH0.7g/L、MgSO₄·7H₂O0.05g/L、K₂HPO₄0.2g/L、NaCl0.12g/L、CuSO₄·5H₂O0.01g/L、NaMoO₄·2H₂O0.05g/L、BaCl₂0.01g/L、MnSO₄·4H₂O0.01g/L、FeSO₄0.01g/L、K[Fe(CN)₆]0.01g/L、Cty?C0.02g/L和余量的蒸餾水，pH值7.0～7.4。

2.根據權利要求1所述的哈工大異養硝化不動細菌L7產低溫羥氨氧化酶的方法，其特征在于所述產酶培養基的組分中CH₃CH₂ONa可由丙酸鹽或丁酸鹽替代。

3.如權利要求1所述哈工大異養硝化不動細菌L7產低溫羥氨氧化酶的方法的進一步分離純化方法，其特征在于哈工大異養硝化不動細菌L7產低溫羥氨氧化酶的分離純化方法按以下步驟進行：

一、將哈工大異養硝化不動細菌L7(AcinetobacterHeteronitrifihitL7)菌株接種到產酶培養基中，接種量為2％，在160rpm/min、15℃培養14～24h，然后在6000rpm離心5min后收集菌體；

二、將菌體用10mmol/L、pH8.5的Tris-HCI緩沖液重懸后置于冰水浴中超聲破碎15min，然后將破碎液采用溶菌酶對細胞進行破碎，將收集的菌體分為細胞質、細胞周質和細胞膜三部分，再通過滲透作用，制備不含溶菌酶的胞外基質；

三、應用DEAE-CL6B離子交換柱對收集的胞外基質進行分離，并用5mM、pH8.0的Tris-HCl進行平衡，在相同的緩沖液中，用0-500mM梯度NaCl進行洗脫，羥氨氧化酶在80mM的NaCl條件下從離子交換柱中洗脫下來，然后通過交聯聚丙烯酰胺葡聚糖S-100凝膠層析去除細胞色素C₅₅₁，再變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，收集分子量60.4KDa的單體蛋白，即完成哈工大異養硝化不動細菌L7產低溫羥氨氧化酶的分離純化；

其中步驟一中產酶培養基的組分如下：NH₄Cl0.1g/L、CH₃CH₂ONa1.0g/L、NH₂OH0.7g/L、MgSO₄·7H₂O0.05g/L、K₂HPO₄0.2g/L、NaCl0.12g/L、CuSO₄·5H₂O0.01g/L、NaMoO₄·2H₂O0.05g/L、BaCl₂0.01g/L、MnSO₄·4H₂O0.01g/L、FeSO₄0.01g/L、K[Fe(CN)₆]0.01g/L、Cty?C0.02g/L和余量的蒸餾水，pH值7.0～7.4。

4.根據權利要求3所述的哈工大異養硝化不動細菌L7產低溫羥氨氧化酶的分離純化方法，其特征在于步驟一中所述產酶培養基的組分中CH₃CH₂ONa可由丙酸鹽或丁酸鹽替代。