[發(fā)明專利]凝血酶適配體功能化電紡絲增強(qiáng)固相微萃取棒的制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310201032.3
• 申請日: 2013-05-28
• 公開（公告）號: CN103266175A
• 公開（公告）日: 2013-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜甫佑;孫林;阮貴華
• 申請（專利權(quán)）人: 桂林理工大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N9/74;G01N1/28;C08F220/44;C08F222/06;D01F6/40;D01D5/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析化學(xué)樣品前處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種凝血酶適配體功能化電紡絲增強(qiáng)固相微萃取棒的制備方法，所制備的凝血酶適配體功能化電紡絲增強(qiáng)固相微萃取棒適用于環(huán)境、食品、醫(yī)藥及生物等領(lǐng)域中復(fù)雜基體中目標(biāo)成分的痕量目標(biāo)物的分離、純化和分析。

背景技術(shù)

凝血酶是由凝血酶前體（血漿中的必要成分）形成的蛋白質(zhì)水解酶，催化纖維蛋白元變成纖維蛋白而促使血液凝固。凝血酶含量的多少可用于一些疾病診斷，如遺傳性出血病或凝血障礙性疾病的監(jiān)測；另一方面，凝血酶用于結(jié)扎止血困難的小血管、毛細(xì)血管以及實質(zhì)性臟器出血的止血，以及用于外傷、手術(shù)、口腔、耳鼻喉、泌尿、燒傷、骨科、等出血的止血。因此，檢測血液、血清或血漿中凝血酶的含量可診斷疾病及控制手術(shù)過程中的止血。

在分析復(fù)雜血液、血清或血漿樣品中的凝血酶時，樣品前處理技術(shù)是其中的關(guān)鍵之一。固相微萃?。⊿PME）技術(shù)是90年代興起的一種新穎的樣品前處理技術(shù)，集進(jìn)樣、萃取、濃縮功能于一體。涂層材料是固相微萃取技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵，目前的涂層材料在復(fù)雜基體中痕量目標(biāo)物的分離富集方面仍存在特異性低、萃取能力小等問題，尤其是生物樣品中痕量蛋白質(zhì)等的分離分析仍面臨很多的挑戰(zhàn)。

適配體是一種能與蛋白質(zhì)或代謝物等配體特異和高效結(jié)合的RNA或DNA片段，可特異性、高親和力識別靶分子。由于其分子量較小，可化學(xué)合成、穩(wěn)定性好、沒有毒性等優(yōu)點，在許多方面體現(xiàn)了傳統(tǒng)的免疫學(xué)與化學(xué)分子識別無可比擬的優(yōu)勢，在疾病診斷、癌癥治療和高靈敏分析等方面顯示重要的應(yīng)用前景，已成為分析化學(xué)進(jìn)展最為迅速的學(xué)科前沿之一。適配體在分離、富集及純化方面展現(xiàn)了其特有的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有固相微萃取技術(shù)選擇性不夠的局限性，提供一種凝血酶適配體功能化電紡絲增強(qiáng)固相微萃取棒的制備方法及應(yīng)用。

本發(fā)明的思路：首先采用自由基水相沉淀聚合方法合成聚丙烯腈-馬來酸聚合物，再直接以不銹鋼絲為底材，用電紡絲技術(shù)制備表面積大、穩(wěn)定性高、耐用性強(qiáng)的固相萃取棒，并采用碳二亞胺法將凝血酶適配體固定于萃取棒表面，制備凝血酶適配體功能化電紡絲增強(qiáng)固相微萃取棒。

具體步驟為：

(1)采用自由基水相沉淀聚合方法合成聚丙烯腈-馬來酸聚合物:?在圓底燒瓶中加入10.6克丙烯腈和7.4克馬來酸苷，再加入20毫升60?℃的去離子水，60?℃下恒溫水浴并攪拌；通入氮氣10分鐘后，加入135毫克?K₂S₂O₈和75毫克Na₂SO₃引發(fā)自由基水相沉淀聚合反應(yīng)，并將反應(yīng)的混合溶液迅速采用質(zhì)量百分比濃度為40~60%的稀H₂SO₄調(diào)至pH值為?2.0，聚合反應(yīng)3?小時，所得產(chǎn)物用去離子水和無水乙醇輪流洗滌4~6次即制得聚丙烯腈-馬來酸聚合物。

(2)采用電紡絲技術(shù)將步驟(1)制得的聚丙烯腈-馬來酸聚合物固定在不銹鋼絲表面制成固相微萃取棒:?將4.0克步驟(1)制得的聚丙烯腈-馬來酸聚合物加入到50毫升二甲基甲酰胺中，攪拌至完全溶解，制得聚合物溶液；采用電紡絲技術(shù)將聚合物溶液紡絲，接收端為不銹鋼絲，其尺寸為長55毫米×直徑1.5?毫米，紡絲電壓為10?千伏，噴絲端與接收端距離為130?毫米，流速為0.30?毫升/小時，紡絲時間為50分鐘；不銹鋼絲上電噴絲長度為30?毫米，厚度為60-65微米。

(3)通過碳二亞胺方法將凝血酶適配體固定在步驟(2)制成的固相微萃取棒涂層上:?

a、在50?毫摩爾/升且?pH值為8.0的磷酸緩沖液中加入碳二亞胺即EDC和N-羥基丁二酰亞胺即NHS，制得碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺的濃度均為100?毫摩爾/升的EDC/NHS混合溶液。

b、將3根步驟(2)制成的固相微萃取棒放入到2.0?毫升步驟(3)第a?步制得的EDC/NHS混合溶液中活化2小時，再加入200?納摩爾氨基化的凝血酶適配體即5′/5AmMC6/-AGT?CCG?TGG?TAG?GGC?AGG?TTG?GGG?TGA?CT-3′，室溫反應(yīng)過夜，即制得凝血酶適配體功能化電紡絲增強(qiáng)固相微萃取棒。?

所述化學(xué)試劑的純度均為化學(xué)純以上純度。

本發(fā)明制得的凝血酶適配體功能化電紡絲增強(qiáng)固相微萃取棒能應(yīng)用于人血清、人血漿和人血液等復(fù)雜樣品中痕量凝血酶的選擇性分離、富集和分析。

本發(fā)明優(yōu)點：