[發明專利]一種高純度重組人BAFF的制備方法

有效

• 申請號: 201310198851.7
• 申請日: 2013-05-24
• 公開（公告）號: CN103275988A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 崔縣偉;季晨博;付子毅;郭錫熔
• 申請（專利權）人: 南京市婦幼保健院
• 主分類號: C12N15/28
• 分類號: C12N15/28;C12N15/70;C12N15/11;C07K14/525
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說涉及一種高純度重組人BAFF的制備方法，以及對應的優化后人BAFF核苷酸序列，及用于擴增該序列的引物。

背景技術

B淋巴細胞刺激因子（Bcell?activating?factor?belonging?to?the?TNF?family,BAFF）是腫瘤壞死因子（TNF）的成員，能與B淋巴細胞特異性結合并誘導其增殖、成熟、分化并分泌IgG、IgA和IgM等免疫球蛋白。人BAFF（hBAFF）屬II型跨膜蛋白，全長285個氨基酸。

有研究表明系統性紅斑狼瘡（SLE）和類風濕性關節炎（RA）等自身免疫性疾病與BAFF的過量表達有關，目前也有相關技術通過研究BAFF拮抗劑藥物或抗BAFF血清治療相關疾病。其中涉及到通過獲得大量可溶性BAFF用于研究BAFF與人類自身免疫的機理，以及用作免疫治療的必要組分。

由于BAFF主要以不可溶的包涵體形式存在，在提取過程中存在困難，利用傳統親和層系純化的方法獲得的BAFF量非常小。

發明內容

發明目的：本發明的目的是提供一種利用尿素逐步變性除雜法獲得高純度重組人BAFF的方法，本發明的另一個目的是提供一種功能區經原核細胞適應性密碼子優化的人BAFF核苷酸序列，本發明還有一個目的是提供用于擴增上述功能區核苷酸序列的引物。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明的一種經原核細胞適應性密碼子優化的人BAFF基因，其用于表達134-285氨基酸的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.01所示。

所述SEQ?ID?NO.01對應的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.02所示。

一種高純度重組人BAFF的制備方法，該方法將優化后的人BAFF功能區的核苷酸序列載入原核表達載體，轉入原核細胞進行培養后誘導表達，離心破碎后，對沉淀包涵體采用尿素逐步變性法除雜，獲得高純度的重組人BAFF蛋白；

其中，所述優化后的人BAFF核苷酸序列的功能區如SEQ?ID?NO.01所示。

人BAFF134-285氨基酸為短可溶功能區（sBAFF），通過相關引物和酶將該片段載入原核表達載體中。具體地說，用于載入SEQ?ID?NO.01的原核表達載體為pET28a質粒，用于表達載體的原核細胞為DH5a受感態細胞。所用引物BAFF-F和BAFF-R如SEQID?NO.03和SEQ?ID?NO.04所示，即：

BAFF-F:CGCCATATGGCTGTTCAGGGTCCGGAAGAAAC，

BAFF-R:CCCAAGCTTTTACAGCAGTTTCAGAGCACCG，

其中，劃線部分分別為NdeI和HindIII的酶切位點。切斷后利用連接酶連接，即構建了pET28a-sBAFF載體，然后接種到DH5a受感態細胞中。

將上述含有pET28a-sBAFF的DH5a接種到LB液體培養基中預培養，然后接種到自動誘導培養基中，加入卡那霉素后振搖培養。

其中，所述自動誘導培養基包括：

Buffer?III(50X每1000ml+Buffer-III:20ml)

K₂HPO₄?????????15g

KH₂PO₄?????????10g

(NH₄)₂HPO₄?????25g

H₂O到100ml；

Buffer?II(20X?Inducer每1000ml+Buffer-II:50ml)

Lactose?????136g

Glycerol????100g(84ml)

MgSO₄???????1g

H₂O到1000ml；

Buffer?I(1000X每1000ml+Buffer-I：1-10ml)

Glucose?????100g

MgSO₄???????5%

H₂O到1000ml。