[發明專利]一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性胺的方法

有效

• 申請號: 201310198839.6
• 申請日: 2013-05-24
• 公開（公告）號: CN103224963A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 王世珍;方柏山
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12R1/38
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及一種手性胺，尤其是涉及一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性胺的方法。

背景技術

手性胺是重要的醫藥和精細化工中間體，也可用作金屬手性配體和手性助劑的手性源[Applied?Organometallic?Chemistry,2011,25:110-116]，催化羰基的不對稱還原。手性胺還可以作為手性拆分試劑用于外消旋體拆分。手性胺可通過化學合成和生物催化制備。手性胺的化學制備方法主要有：氨基酸或其衍生物的還原、醛或酮與亞胺的偶合以及環氧化合物的氨基化開環等。生物法制備手性胺主要通過酶催化拆分或不對稱還原實現。

用于制備手性胺的酶主要有脂肪酶、轉胺酶和氧化還原酶。脂肪酶（Lipase）可催化拆分消旋胺獲得手性胺，理論產率為50%，并存在后續分離的問題[Journal?of?the?American?Chemical?Society,2010,132:14179-14190]。利用轉氨酶（Transaminases）催化羥酮發生氨基轉移反應是目前制備手性氨基醇的主要方法。轉氨酶可催化氨基供體（氨基酸或胺）與氨基受體（酮）之間氨基轉移。該反應是可逆反應，由于生成的酮和胺均對轉胺酶有較嚴重的抑制作用，必須除去產物酮以降低其對酶抑制，促使反應正向進行，時空產率較低[Chemical?Communications,2010,46:5569-5571]。

催化酮基不對稱還原胺化獲得手性胺，并以NAD(P)H為輔酶的胺脫氫酶，是理想的制備手性氨基醇的生物催化劑，其反應路線簡潔，易實現輔酶再生。Abrahamson等對來源于Bacillus?stereothermophilus的亮氨酸脫氫酶進行多輪定點突變，獲得新型胺脫氫酶，可選擇性還原甲基異丁基酮為(R)-1,3-二甲基丁基胺。該酶催化不對稱胺還原，轉化率可達92%，活性為0.69U/mg,產物ee值為99.8%[Angewandte?Chemie?International?Edition.201251:3969-3972]。Itoh等人從Streptomyces?virginiae?IFO12827中分離純化得到依賴輔酶NADH的胺脫氫酶，在pH10的條件下催化系列羥酮還原胺化生成氨基醇，pH7時反方向催化氨基醇生成相應的羥酮[Journal?of?Molecular?Catalysis?B-Enzymatic,2000,10:281-290.]。但該酶的反應選擇性尚屬較低，且無基因和蛋白結構等信息的報道。因此，篩選含有催化不對稱還原胺化高活性高選擇性的胺脫氫酶的菌株是實現手性胺有效制備的關鍵。

發明內容

本發明的目的在于提供一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性胺的方法。

本發明包括以下步驟：

1）細胞液制備：將菌種接入216L培養基中培養，再將培養后獲得的發酵液離心獲得細胞，用緩沖液重懸、洗滌，配制成細胞液；

2）全細胞催化反應：在步驟1）得到的細胞液中，加入酮作為底物，再加入氨基供體和輔助底物，用于輔酶循環再生，利用細胞催化不對稱還原胺化得到產物手性胺。

在步驟1）中，所述菌種為基爾假單胞菌(Pseudomonas?kilonensis)，基爾假單胞菌(Pseudomonas?kilonensis)從中國海洋微生物菌種保藏管理中心獲得，該中心的保藏編號為MCCC?NO.1A06062；所述將菌種接入216L培養基中培養的菌種接種量可為1%；所述216L培養基的組成為10.0g/L蛋白胨,5.0g/L酵母粉,0.5g/L牛肉膏,0.5g/L檸檬酸鈉,0.2g/LNH4NO3,1.0g/L?NaAc，用海水配制；所述培養的條件可為：起始pH7.0，裝液量體積分數為10%，培養溫度30℃，搖床轉速150rpm，培養時間72h；所述離心可采用冷凍離心機，離心的條件可為4℃，10000rpm，15min，獲得細胞；所述用緩沖液重懸、洗滌可棄上清液，緩沖液重懸，洗滌后離心，重復操作3次；所述細胞液的濃度可為0.025～100g/L；所述緩沖液可選自0.01～0.2mol/L的pH為7～13的Tris-鹽酸、乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸鉀等中的至少一種，優選pH9的Tris-鹽酸緩沖液。