[發(fā)明專利]鑒別空腸彎曲菌及大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變的熒光PCR方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310198811.2
• 申請(qǐng)日: 2013-05-24
• 公開（公告）號(hào): CN103421892A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁宗輝;劉杰;郝海紅;王玉蓮;戴夢(mèng)紅;黃玲利;程古月;王旭;彭大鵬;陳冬梅;陶燕飛;劉振利;謝長(zhǎng)清
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/10;G01N21/64
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。與多重?zé)晒舛縋CR方法有關(guān)。本發(fā)明具體涉及一種利用熒光定量PCR法鑒別空腸彎曲桿菌及其大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)突變，在同一反應(yīng)體系中，不僅可以對(duì)空腸彎曲桿菌進(jìn)行種屬鑒定，而且可以同時(shí)檢測(cè)空腸彎曲桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥靶基因23S?rDNA和rplD基因的變異情況。

背景技術(shù)

彎曲桿菌(Campylobacter?spp)，包括空腸彎曲桿菌(Campylobacter?jejuni)、結(jié)腸彎曲桿菌(Campylobacter?coli)和胎兒彎曲桿菌(Campylobacter.lari)等，均為革蘭氏陰性、高度可運(yùn)動(dòng)、微需氧性和嗜熱性細(xì)菌。其中，空腸彎曲桿菌廣泛存在于各種動(dòng)物體內(nèi)，可以通過被污染的水源、生奶和未完全加工熟的肉類食品感染人類，引起人和動(dòng)物的多種疾病，被認(rèn)為是引起全世界人類細(xì)菌性腹瀉的主要病原菌(Moore?et?al.，2006)。空腸彎曲桿菌作為一種微需氧菌，對(duì)培養(yǎng)條件要求較苛刻，常規(guī)的分離培養(yǎng)和生化鑒定耗時(shí)費(fèi)力、靈敏度不高。已有的分子生物學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，空腸彎曲桿菌的16S?rRNA基因、23S?rRNA基因、鞭毛蛋白基因(flaA、flaB)、含鐵細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因(ceuE)、細(xì)胞致死性膨脹毒素基因(cdt基因)、外膜纖維結(jié)合蛋白基因(cadF)、外膜蛋白基因(omp50)以及VS1基因等都可以用作特異性鑒別彎曲桿菌的靶基因。其中，VS1基因特異性存在于空腸彎曲桿菌中。2003年，陽(yáng)成波等(Yang?et?al.，2004)根據(jù)空腸彎曲菌的VS1基因中的保守片段設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立一種快速?gòu)氖称泛退袡z測(cè)空腸彎曲桿菌的PCR方法。檢測(cè)結(jié)果顯示該P(yáng)CR方法只對(duì)空腸彎曲桿菌能擴(kuò)增出358bp的片段，而對(duì)結(jié)腸彎曲桿菌、胎兒彎曲桿菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌等均不能擴(kuò)增出該片段，檢測(cè)靈敏度達(dá)8CFU/ml，特異性與常規(guī)生化檢查是一致的。中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-食品中多種致病菌快速檢測(cè)-PCR方法中所用的特異性引物也是根據(jù)空腸彎曲菌特有的靶序列VS1基因設(shè)計(jì)的，長(zhǎng)度也為358bp。

大環(huán)內(nèi)酯類藥物，是空腸彎曲桿菌感染的首選藥物之一。隨著此類藥物，如紅霉素、螺旋霉素、泰樂菌素和替米考星等，在獸醫(yī)和人醫(yī)臨床中的廣泛應(yīng)用和不合理使用，彎曲桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性問題已經(jīng)引起了世界的廣泛關(guān)注。23S?rRNA?V區(qū)和核糖體蛋白L4、L22上的位點(diǎn)突變是介導(dǎo)空腸彎曲桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性的主要途徑(Payot?et?al.，2006)。其中23S?rRNA?V區(qū)的位點(diǎn)突變通常導(dǎo)致空腸彎曲桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的高水平耐藥(紅霉素MIC≥256μg/ml)，核糖體蛋白L4和L22上的位點(diǎn)突變往往出現(xiàn)在中水平耐藥(紅霉素MIC為8～128μg/ml)菌株中。目前用于檢測(cè)空腸彎曲桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性的方法有：PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)、PCR-單鏈探針反向雜交(PCR-LiPA)、焦磷酸測(cè)序、錯(cuò)配PCR(MAMA-PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real?Time-PCR)等。

Niwa等(Niwa?et?al.，2001)在2001年建立了一種PCR-LiPA方法，他們利用10個(gè)寡核苷酸探針來檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌的23S?rDNA上2072、2073和2074位點(diǎn)的突變，檢測(cè)結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果一致，準(zhǔn)確性較高。但是該方法需經(jīng)過引物標(biāo)記、PCR擴(kuò)增、寡核苷酸探針膠條的制備、反向雜交和酶聯(lián)免疫顯色等多個(gè)步驟，工序多，耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，不夠方便快捷。

Vacher等(Vacher?et?al.，2003)于2003年建立了一種用于檢測(cè)空腸彎曲桿菌23S?rRNA上耐藥相關(guān)突變的PCR-RFLP方法。他們先用PCR擴(kuò)增出空腸彎曲桿菌核糖體23SrRNA?V區(qū)的一段316bp的片段，然后用BsaI和BceAI兩種酶進(jìn)行切割，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶的長(zhǎng)度來判斷是否存在耐藥相關(guān)突變。該方法需要先后經(jīng)過PCR擴(kuò)增、特異性內(nèi)切酶消化和瓊脂糖凝膠電泳三個(gè)步驟，操作相對(duì)比較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。

Alonso等(Alonso?et?al.，2005)在2005年建立了一種MAMA-PCR方法，用于檢測(cè)空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌中23S?rRNA上與紅霉素耐藥相關(guān)的突變。該方法比傳統(tǒng)測(cè)序方法和PCR-RFLP成本低、耗時(shí)短，并且簡(jiǎn)便易行。但是由于無(wú)法擺脫普通PCR最后要用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的步驟，因此無(wú)法避免EB(DNA顯色劑)對(duì)人體的傷害。