[發明專利]鑒別空腸彎曲菌及大環內酯類耐藥突變的熒光PCR方法

有效

• 申請號: 201310198811.2
• 申請日: 2013-05-24
• 公開（公告）號: CN103421892A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 袁宗輝;劉杰;郝海紅;王玉蓮;戴夢紅;黃玲利;程古月;王旭;彭大鵬;陳冬梅;陶燕飛;劉振利;謝長清
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;G01N21/64
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種檢測空腸彎曲桿菌及其大環內酯類耐藥位點突變的多重熒光定量PCR方法，其特征在于：利用特異性的熒光定量PCR反應液和熒光定量PCR反應條件，快速鑒別空腸彎曲桿菌及檢測空腸彎曲桿菌對大環內酯類藥物耐藥靶基因的位點突變，所述的靶基因位點突變分別為空腸彎曲桿菌23SrRNA基因第2074和2075位突變，核糖體蛋白L4編碼基因rplD?170位和221位突變；

所述的熒光定量PCR反應液中分別含有VS1引物對和熒光探針組合，23S?rRNA引物對和熒光探針組合，以及rplD的引物對和熒光探針組合：

①VS1引物對和熒光探針組合

正向引物VS1-RT-F，其DNA序列如序列表SEQ?ID?NO：8所示；

反向引物VS1-RT-R，其DNA序列如序列表SEQ?ID?NO：9所示；

VS1-MGB熒光探針，其DNA序列如序列表SEQ?ID?NO：10所示；

利用引物對VS1-RT-F和VS1-RT-R擴增得到214bp的片段，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：11所示，該片段位于空腸彎曲桿菌特異性鑒別基因VS1全序列的931～1144位；VS1-MGB熒光探針的5’端以HEX熒光基團標記，3’端以非熒光淬滅基團標記，并連接小型凹槽結合物MGB基團，以提高探針的退火溫度；利用引物對VS1-RT-F和VS1-RT-R及探針VS1-MGB組合對空腸彎曲桿菌進行特異性種屬鑒別；

②23S?rRNA引物對和熒光探針組合

正向引物23S-RT-F，其DNA序列如SEQ?ID?NO：1所示；

反向引物23S-RT-R，其DNA序列如SEQ?ID?NO：2所示；

23Sr?RNA-MGB熒光探針，其DNA序列如SEQ?ID?NO：3所示；

利用引物對23S-RT-F和23S-RT-R擴增得到96bp的片段，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：12所示；該片段位于空腸彎曲桿菌大環內酯類耐藥靶基因23S?rRNA基因全序列的第2020～2115位；23SrRNA-MGB熒光探針的5’端以TAMRA熒光基團標記，3’端以非熒光淬滅基團和MGB基團標記，該探針與野生型23S?rRNA基因全序列的第2068～2080位序列結合，從而檢測23S?rRNA基因全序列第2074和2075位是否發生突變；

③rplD的引物對和熒光探針組合

正向引物rplD-RT-F，其DNA序列如SEQ?ID?NO：4所示；

反向引物rplD-RT-R，其DNA序列如SEQ?ID?NO：5所示；

170A-MGB熒光探針，其DNA序列如SEQ?ID?NO：6所示；

221A-MGB熒光探針，其DNA序列如SEQ?ID?NO：7所示；

利用引物對rplD-RT-F和rplD-RT-R擴增得到134bp的片段，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：13所示，該片段位于空腸彎曲桿菌大環內酯類耐藥靶基因rplD全序列的第120～253位；170A-MGB和221A-MGB探針5’端以FAM熒光基團標記，3’端以非熒光淬滅基團和MGB基團標記，利用這兩條探針分別對rplD基因全序列第170位和221位的基因突變進行檢測。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的熒光定量PCR反應液總體積為25μL，其包含Taq酶1～5U，MgSO₄0.75～2.5mM，dNTPs75～250μM，6條引物VS1-RT-F和VS1-RT-R、23S-RT-F和23S-RT-R及rplD-RT-F和rplD-RT-R各0.2～0.6μM，VS1-MGB探針和23SrRNA-MGB探針各為0.1～0.45μM，170A-MGB探針和221A-MGB探針各為0.1～0.45μM。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的熒光定量PCR反應條件為：94℃/95℃10秒～5min1個循環；94℃/95℃5～10秒、56～60℃20～50秒，共計30～50個循環。