[發(fā)明專利]一種具自溶功能的重組菌及其制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310198529.4
• 申請(qǐng)日: 2013-05-24
• 公開（公告）號(hào): CN103275913A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周志剛;楊雅麟;張美超;徐俐;何夙旭;李青;余強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/63;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種具自溶功能的重組菌及其制備方法與應(yīng)用。?

背景技術(shù)

隨著病原菌耐藥性特別是多重耐藥性的日益嚴(yán)重，抗菌藥作用新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和新型抗菌藥物的研發(fā)顯得尤為重要。眾多病原菌的致病基因受到群體感應(yīng)(QS)的調(diào)控，包括毒力因子、黏附因子以及介導(dǎo)病原菌抵抗宿主免疫和藥物的相關(guān)基因。在QS系統(tǒng)中調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)的關(guān)鍵是QS系統(tǒng)中信號(hào)分子的濃度，如有效降低信號(hào)分子的濃度，就可以調(diào)控一些致病菌的致病性。而具有降解信號(hào)分子功能的淬滅酶就是其中一種重要的潛在生物防治手段。?

E7裂解蛋白是產(chǎn)大腸桿菌素細(xì)胞中SOS響應(yīng)系統(tǒng)中的一個(gè)關(guān)鍵成分，其功能是在壓力環(huán)境下輸出細(xì)菌素到細(xì)胞外空間。最近的研究已表明，E7裂解蛋白造成內(nèi)膜傷害，可能與激活用于外膜修飾的外膜磷脂酶A有關(guān)。?

由于許多的淬滅酶來源于細(xì)菌，因此在進(jìn)行基因工程研究的時(shí)候多數(shù)采用細(xì)菌表達(dá)載體進(jìn)行研究，其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的最為清楚。而目前大腸桿菌工程菌存在目標(biāo)蛋白分泌表達(dá)量低、胞內(nèi)表達(dá)需破壁工序增加成本而限制其工業(yè)化的這種現(xiàn)狀。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種重組菌的制備方法，利用該方法獲得的重組菌具有自溶功能，可減少重組菌的破壁工序，降低目的蛋白的生產(chǎn)成本。?

本發(fā)明所提供重組菌的制備方法包括：將E7裂解蛋白的編碼基因和目的蛋白的編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌中，獲得重組菌。?

在上述方法中，所述E7裂解蛋白可為序列表序列2所示蛋白；和/或，所述目的蛋白可為淬滅酶；?

所述淬滅酶具體可為序列表序列5所示的蛋白。?

在上述方法中，所述E7裂解蛋白的編碼基因可為序列表序列1的第52位至第195位所示基因；?

和/或，所述目的蛋白編碼基因?yàn)樾蛄斜硇蛄?的第9位至第818位所示基因。?

在上述方法中，所述E7裂解蛋白編碼基因和目的蛋白編碼基因通過重組載體C導(dǎo)入所述出發(fā)菌中獲得工程菌；?

所述重組載體C按照包括如下步驟的方法制備：?

在質(zhì)粒pET-28a(+)T7啟動(dòng)子上游插入所述E7裂解蛋白編碼基因表達(dá)盒獲得重組載體B；在所述重組載體B的所述T7啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)處插入所述目的蛋白編?碼基因，獲得所述重組載體C；所述E7裂解蛋白編碼基因表達(dá)盒的啟動(dòng)子具體可為T7啟動(dòng)子。?

所述重組載體C進(jìn)一步具體可按照包括如下步驟的方法制備：?

在質(zhì)粒pET-28a(+)的XbaⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)之間插入序列表序列1的第17位至第195位核苷酸所示的DNA片段獲得重組載體A，在所述重組載體A的SphⅠ和BglⅡ酶切位點(diǎn)之間插入序列表序列3的第16位至第398位核苷酸所示的DNA片段獲得重組載體B，在所述重組載體B的EcoR?I和Not?I酶切位點(diǎn)之間插入序列表序列4的第9位至第818位核苷酸所示的DNA片段獲得所述重組載體C。?

在上述方法中，所述出發(fā)菌可為大腸桿菌(Escherichia?coli)，具體可為大腸桿菌(Escherichia?coli)BL21(DE3)。?

本發(fā)明保護(hù)上述任一所述方法制備得到的重組菌。?

本發(fā)明保護(hù)上述任一所述方法制備得到的重組菌在制備所述目的蛋白中的應(yīng)用。?

本發(fā)明還提供一種制備目的蛋白的方法，包括如下步驟：將上述任一所述方法制備得到的重組菌用發(fā)酵培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀=1.0，然后加入IPTG至終濃度為0—1mmol/L（如0、0.25、0.5或1mmol/L），于30℃、180rpm、旋轉(zhuǎn)半徑為1.3cm的條件下繼續(xù)震蕩培養(yǎng)1—24小時(shí)（如1、2、4、8、12、24小時(shí)），獲得所述目的蛋白；?

當(dāng)所述重組菌的出發(fā)菌為大腸桿菌時(shí)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其終濃度分別為蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油4ml/L、KH₂PO₄0.231g/L、K₂HPO₄1.254g/L和葡萄糖5g/L。?

所述重組載體B也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述重組載體B可作為構(gòu)建目的蛋白表達(dá)的出發(fā)載體，以便于制備所述重組菌并生產(chǎn)所述目的蛋白。?