[發明專利]一種具自溶功能的重組菌及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201310198529.4
• 申請日: 2013-05-24
• 公開（公告）號: CN103275913A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 周志剛;楊雅麟;張美超;徐俐;何夙旭;李青;余強
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/63;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.一種重組菌的制備方法，包括將E7裂解蛋白編碼基因和目的蛋白編碼基因導入出發細菌中，獲得重組菌。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述E7裂解蛋白為序列表序列2所示蛋白；和/或，所述目的蛋白為淬滅酶；

所述淬滅酶具體可為序列表序列5所示的蛋白。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述E7裂解蛋白編碼基因為序列表序列1的第52位至第195位所示基因；

和/或，所述目的蛋白編碼基因為序列表序列4的第9位至第818位所示基因。

4.根據權利要求1—3中任一所述的方法，其特征在于：所述E7裂解蛋白編碼基因和目的蛋白編碼基因通過重組載體C導入所述出發菌中獲得重組菌；所述重組載體C按照包括如下步驟的方法制備得到的：

在質粒pET-28a(+)T7啟動子上游插入所述E7裂解蛋白編碼基因表達盒獲得重組載體B；在所述重組載體B的所述T7啟動子下游的多克隆位點處插入所述目的蛋白編碼基因，獲得所述重組載體C；

所述E7裂解蛋白編碼基因表達盒的啟動子具體可為T7啟動子；

所述重組載體C進一步具體可按照包括如下步驟的方法制備得到的：在質粒pET-28a(+)的XbaⅠ和XhoⅠ酶切位點之間插入序列表序列1的第17位至第195位核苷酸所示的DNA片段獲得重組載體A，在所述重組載體A的SphⅠ和BglⅡ酶切位點之間插入序列表序列3的第16位至第398位核苷酸所示的DNA片段獲得所述重組載體B，在所述重組載體B的EcoR?I和Not?I酶切位點之間插入序列表序列4的第9位至第815位核苷酸所示的DNA片段獲得所述重組載體C。

5.根據權利要求1—4中任一所述的方法，其特征在于：所述出發菌為大腸桿菌(Escherichia?coli)。

6.權利要求1—5中任一所述方法制備得到的重組菌。

7.權利要求6所述重組菌在制備所述目的蛋白中的應用。

8.一種制備目的蛋白的方法，包括如下步驟：將權利要求6所述重組菌用發酵培養基振蕩培養至OD₆₀₀=1.0，然后加入IPTG至終濃度為0—1mmol/L，于30℃、180rpm、旋轉半徑為1.3cm的條件下繼續震蕩培養1—24小時，獲得所述目的蛋白。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：當權利要求6所述重組菌的出發菌為大腸桿菌時，所述發酵培養基的溶劑為水，溶質及其終濃度分別為蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油4ml/L、KH₂PO₄0.231g/L、K₂HPO₄1.254g/L和葡萄糖5g/L。

10.權利要求4所述方法中的所述重組載體B。